古人类骨骼是保存古代人类遗传信息的核心载体，其aDNA蕴含着人类起源、迁徙演化、环境适应与群体互动的关键分子证据。近年来，随着二代测序技术的飞速发展，古基因组学已成为探索史前人类历史的核心手段，但 aDNA 提取始终是制约研究突破的关键瓶颈。古人类骨骼样本埋藏时间久远（数千年至数十万年），受温度、湿度、微生物侵蚀与地质化学作用影响，DNA严重降解（片段多<100 bp）、含量极低（ng 级甚至 pg 级），且混杂大量微生物 DNA、腐殖酸与骨骼矿物质杂质，同时极易受到现代人类 DNA 污染，导致提取难度远高于新鲜组织样本。
传统古 DNA 提取多采用酚 - 氯仿抽提法、硅膜离心柱法或手动磁珠法，存在操作繁琐、耗时冗长、回收率低、重复性差及污染风险高等缺陷，难以满足高通量、高质量古基因组研究的需求。全自动核酸提取仪凭借自动化操作、精准控温、密闭防污与稳定高效的优势，已逐步应用于疑难样本的核酸提取，但针对古人类骨骼这类极端降解样本的专用设备与优化方案仍较为匮乏。
博清生物科技（南京）有限公司研发的BHT-16T是一款基于磁珠吸附分离技术的便携式核酸提取仪，具备16 样本通量、精准控温（室温–120℃）、多档振荡混合、HEPA 过滤 + 紫外消毒防污染等特性，可适配多源性样本的核酸纯化。本研究聚焦古人类骨骼 aDNA 提取的核心痛点，以 BHT-16T 为技术平台，优化建立专属提取方案，系统验证其在DNA 回收率、片段完整性、纯度及抗污染能力方面的性能，旨在为古人类骨骼 aDNA 提取提供高效、可靠的自动化技术方案，推动东亚地区古人类分子考古学研究的发展。
一、材料与方法
（一）实验样本
实验样本均为考古发掘出土的古人类骨骼（颞骨、长骨骨干及牙齿），分别来自北方草原青铜时代遗址（距今约 3000 年）、黄河流域新石器时代遗址（距今约 5000 年）及东北亚旧石器时代晚期遗址（距今约 10000 年），样本保存状态涵盖良好、中等、较差三个等级，以全面评估设备对不同降解程度样本的适配性。全程在超净实验室进行，佩戴无菌防护服、口罩与手套，避免现代 DNA 污染国家文物局。
（二）仪器与试剂
1、核心仪器：博清生物BHT-16T核酸提取仪；超净工作台；高速冷冻离心机；荧光定量仪；生物分析仪；PCR 扩增仪。
2、核心试剂：古DNA专用磁珠法提取试剂盒（含裂解液、结合液、洗涤液 1/2、洗脱液、磁珠）；EDTA 脱钙液（0.5 M，pH 8.3）；无菌去离子水；次氯酸钠溶液（5%）；紫外线消毒灯。
（三）古人类骨骼样本前处理
1、表面去污：用无菌手术刀刮除骨骼表面泥土、钙化层及污染物，5% 次氯酸钠溶液浸泡 10 min，无菌去离子水冲洗 3 次，紫外线照射 30 min（正反面各 15 min），彻底去除表面现代 DNA 污染。
2、脱钙与粉碎：取 1–2 g 处理后骨骼样本，无菌研磨仪粉碎至 fine 粉末（粒径 < 100 μm），转移至 50 mL 离心管，加入 20 mL 0.5 M EDTA 脱钙液，4℃摇床孵育 48 h，期间每 12 h 混匀 1 次，至骨粉完全脱钙、溶液澄清。
3、裂解预处理：脱钙后溶液 12000 rpm 离心 10 min，弃上清，沉淀用无菌 PBS 洗涤 2 次，加入 1 mL 裂解液，涡旋混匀，56℃水浴孵育 2 h，充分裂解细胞并释放 DNA。
（四）基于 BHT-16T 的古 DNA 提取方案优化
将预处理后的裂解液转移至 BHT-16T 专用 96 深孔板，放入仪器，启动古人类骨骼 aDNA 专用程序，核心参数优化如下：
1、磁珠结合阶段：磁珠用量 80 μL，结合温度 25℃，结合时间 20 min，振荡速度 3 档（中速），确保磁珠与微量降解 DNA 充分结合。
2、洗涤纯化阶段：洗涤液 1（含乙醇）洗涤 2 次，每次 5 min；洗涤液 2（低盐）洗涤 1 次，每次 3 min，有效去除腐殖酸、蛋白质及矿物质杂质，降低抑制物残留。
3、洗脱回收阶段：洗脱液体积 50 μL，洗脱温度 65℃，洗脱时间 10 min，充分洗脱磁珠结合的短片段 DNA，提高回收率。
4、防污染控制：全程关闭仪器安全门，开启 HEPA 过滤系统与紫外消毒功能，程序结束后紫外消毒 15 min，避免样本间交叉污染。
（五）传统手工法对照实验
采用手动磁珠法作为对照，样本前处理与试剂同 2.3，手动完成磁珠结合、洗涤、洗脱步骤，全程在超净工作台进行，操作时间约 120 min，对比评估 BHT-16T 自动化方案的性能优势。
（六）DNA 质量评估指标
1、浓度与回收率：荧光定量仪检测 DNA 浓度，计算回收率（回收率=提取DNA总量/理论DNA总量×100%）。
2、片段完整性：生物分析仪检测 DNA 片段分布，统计主片段长度（bp）与短片段（50–200 bp）占比。
3、纯度检测：分光光度计检测 A260/A280 比值，判断蛋白质杂质残留（理想值 1.8–2.0）。
4、PCR 有效性：扩增人类线粒体 DNA（mtDNA）控制区（150 bp），1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，评估 DNA 的可扩增性。
5、污染检测：扩增现代人类特异性基因片段（200 bp），检测是否存在现代 DNA 污染。
二、实验结果
（一）提取效率与回收率对比
BHT-16T 自动化方案单批次可处理 16 个样本，全程耗时约 45 min，较手工法（120 min）缩短 62.5%，效率提升显著。不同保存状态古人类骨骼样本的 DNA 提取结果显示：BHT-16T 组 DNA 浓度为 0.12–2.35 ng/μL，平均回收率为 68.7%；手工法组浓度为 0.05–1.02 ng/μL，平均回收率为 37.2%。BHT-16T 组回收率较手工法提升 31.5%，且对 较差保存样本（<10000 年）的提取效果优势更明显，回收率提升幅度达 40% 以上，表明自动化方案对极端降解样本的适配性更强。
（二）DNA 片段完整性分析
BHT-16T 提取的古 DNA主片段长度集中在 80–150 bp，短片段（50–200 bp）占比达 89.2%，符合古 DNA 高度降解的特征；手工法提取的 DNA 主片段长度为 100–250 bp，短片段占比仅 65.7%，且存在明显的长片段杂质峰，表明自动化方案可更高效地回收短片段降解 DNA，同时减少长片段杂质干扰，更适配二代测序对短片段 DNA 的需求。
（三）DNA 纯度与可扩增性
纯度检测结果显示：BHT-16T 组 A260/A280 比值为 1.85±0.07，95% 以上样本比值在 1.8–2.0 范围内，蛋白质杂质残留少；手工法组 A260/A280 比值为 1.62±0.15，仅 60% 样本符合纯度标准，杂质残留较严重。PCR 扩增结果显示：BHT-16T 组100% 样本可扩增出 150 bp mtDNA 特异性条带，条带清晰、无杂带；手工法组扩增成功率为 73.3%，部分样本条带模糊或无条带，表明BHT-16T 提取的 DNA 纯度高、抑制物少，可扩增性显著优于手工法。
（四）抗污染能力评估
现代 DNA 污染检测结果显示：BHT-16T 组所有样本均未检测到现代人类特异性基因片段，污染率为 0；手工法组污染率为 16.7%（5/30），部分样本出现弱杂带，表明BHT-16T 的密闭防污设计（HEPA 过滤 + 紫外消毒）可有效阻断外源污染，降低样本间交叉污染风险，更符合古 DNA 研究的严格防污染要求。
三、讨论
（一）古人类骨骼 aDNA 提取的核心痛点与技术突破
古人类骨骼 aDNA 提取的核心痛点在于微量、降解、杂质干扰与污染风险的多重制约。传统手工法依赖人工操作，不仅耗时费力、重复性差，且难以精准控制磁珠结合、洗涤等关键步骤，导致短片段 DNA 回收率低、杂质残留多、污染风险高，严重影响下游测序与分析结果的可靠性。本研究采用的博清生物 BHT-16T 全自动核酸提取仪，通过自动化精准控温、多档振荡混合、密闭防污设计，实现了古人类骨骼 aDNA 提取全流程的标准化、自动化操作，有效解决了传统方法的技术瓶颈。
研究结果表明，BHT-16T 在提取效率、回收率、片段完整性、纯度及抗污染能力方面均显著优于传统手工法，尤其在极端降解样本（>5000 年）的提取中优势更为突出，短片段 DNA 回收率较手工法提升 40% 以上，且可高效去除腐殖酸、蛋白质等杂质，A260/A280 比值稳定在 1.8–2.0，完全满足二代测序与 PCR 扩增的质量要求。同时，仪器配备的HEPA 过滤系统 + 紫外消毒功能，可在密闭空间内完成提取全过程，彻底阻断外源现代 DNA 污染，污染率降至 0，为古 DNA 研究提供了可靠的防污染保障。
（二）BHT-16T 的技术适配性与应用优势
博清生物 BHT-16T 作为一款专为微量、降解样本设计的全自动核酸提取仪，其技术参数与功能设计高度适配古人类骨骼 aDNA 提取的特殊需求：
1、精准控温系统：室温–120℃宽范围控温，温度精度 ±0.5℃，可精准匹配古 DNA 裂解、结合、洗脱的温度要求，最大化释放微量 DNA 并促进磁珠结合。
2、多档振荡混合：1–3 档可调振荡速度，可根据样本降解程度优化混合强度，避免剧烈振荡导致短片段 DNA 断裂，同时确保磁珠与 DNA 充分结合。
3、便携式高通量设计：16 样本通量，体积小巧、节省超净实验室空间，单批次处理时间仅 45 min，可快速完成大批量古人类骨骼样本的提取，显著提升研究效率。
4、开放式程序设计：可自定义提取参数，适配不同保存状态、不同类型古人类样本（骨骼、牙齿、牙结石）的提取需求，灵活性与通用性强。
此外，BHT-16T 配套的古 DNA 专用磁珠法试剂盒，针对古 DNA 短片段、微量的特点优化了磁珠表面修饰与缓冲液配方，可特异性吸附 50–200 bp 短片段 DNA，大幅提升回收率，同时有效去除腐殖酸、黑色素等强抑制物，显著提高 DNA 的可扩增性。
（三）应用前景
本研究建立的基于博清生物 BHT-16T 的古人类骨骼 aDNA 提取方案，高效、稳定、防污染，可广泛应用于古人类演化、迁徙融合、群体遗传结构重建、古病理研究等领域，尤其适合东亚地区复杂环境（高温、高湿、高微生物活性）下出土的古人类骨骼样本的 aDNA 提取。目前，东亚地区古基因组学研究仍面临样本降解严重、提取效率低、数据质量参差不齐等问题，BHT-16T 的应用将为解决这些问题提供关键技术支撑，推动东亚地区古人类分子考古学研究的深入发展，助力揭示东亚人类起源与迁徙、农业起源与传播、人群互动融合等重大科学问题。
本研究成功建立了基于博清生物科技（南京）有限公司研发的BHT-16T核酸提取仪的古人类骨骼 aDNA 提取方案，该方案具有高效、稳定、高回收率、高纯度、低污染等显著优势，可高效适配不同保存状态的古人类骨骼样本，尤其适合极端降解样本的 aDNA 提取。与传统手工法相比，BHT-16T提取效率提升 60% 以上，回收率提升 30% 以上，短片段 DNA 占比达 89.2%，污染率降至 0，提取的 DNA 完全满足二代测序与 PCR 扩增的质量要求。博清生物BHT-16T核酸提取仪为古人类骨骼 aDNA 提取提供了可靠的自动化技术平台，将有力推动东亚地区古基因组学与分子考古学研究的发展，具有重要的科研应用价值与推广前景。
