基因表达差异分析是生命科学基础研究的核心手段，广泛用于细胞功能解析、药物靶点挖掘、致病机制探究、微生物胁迫应答等领域。RNA‑seq转录组测序能够一次性获得全基因组转录信息，批量筛选大量差异表达基因（DEGs），但受测序深度、样本背景、生物信息学算法影响，测序结果存在一定假阳性，转录组得到的差异基因必须通过 RT‑qPCR 进行实验层面验证，才能作为可靠的实验结论。
RT‑qPCR验证的质量高度依赖仪器性能：控温精度、模块均一性、荧光检测灵敏度、重复性、熔解曲线分辨能力直接决定Cq值可靠性，进而影响基因倍数变化的计算与统计结果。博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪采用珀耳帖精密控温系统，多通道光学检测架构，支持SYBR Green染料法与TaqMan探针法，兼容绝对定量、熔解曲线分析，适配96孔高通量样本检测，适合转录组后续大批量候选基因验证工作。
一、材料与方法
（一）实验材料与仪器
1、细胞样本：对照组与药物处理组细胞样本；
2、试剂：总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green qPCR预混液，目标基因及内参基因特异性引物；
3、仪器：博清生物荧光定量PCR仪；高速冷冻离心机；核酸蛋白检测仪；低温冰箱。
（二）转录组差异基因筛选
对对照组与处理组样本开展RNA‑seq转录组测序。筛选阈值设置：|log₂FC|＞1，校正后P‑value＜0.05，获得差异表达基因集，包含上调基因、下调基因。结合GO、KEGG通路富集结果，优先选择通路核心基因，兼顾高、中、低不同表达丰度，挑选若干候选基因作为qPCR验证对象，同时筛选2个稳定性良好的内参基因用于数据归一化校正。
（三）RNA提取与cDNA合成
收集两组细胞样本，提取总RNA，检测RNA纯度与完整性，OD₂₆₀/₂₈₀控制在1.8‑2.1之间。取等量总RNA按照试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，‑20℃保存备用。
（四）qPCR扩增体系与程序
采用20 μL反应体系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.4‑0.6 μL，cDNA模板2 μL，无酶水补至20 μL。每个样本设置3次技术重复，设置无模板对照NTC。
博清生物荧光定量PCR仪运行程序：
1、初始变性：95 ℃，3 min；
2、扩增循环（40循环）：95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，此步骤采集荧光信号；
3、熔解曲线程序：65 ℃‑95 ℃，每5 s升温0.5 ℃，采集熔解荧光，评估引物扩增特异性。
二、结果
（一）转录组差异基因筛选结果
转录组测序共得到大量差异基因，其中上调基因数量多于下调基因。通路富集分析显示差异基因集中在信号转导、细胞凋亡、代谢通路等方向。结合基因功能注释，筛选 8 个候选差异基因开展qPCR验证，其中上调基因5个，下调基因3个，同时选定2个内参基因用于校正。
（二）RNA质量与扩增特异性
总RNA检测结果显示样本纯度良好，满足反转录与qPCR实验要求。博清生物荧光定量PCR仪熔解曲线结果显示，全部目标基因均出现单一尖锐熔解峰，无杂峰，NTC无明显扩增信号，说明引物特异性良好，无引物二聚体与非特异性扩增干扰，实验体系可靠。
（三）候选基因qPCR定量验证结果
博清生物荧光定量PCR仪输出Cq值重复性良好，同一样本技术重复Cq偏差小，孔间均一性佳。
qPCR定量结果显示：5个转录组预测上调的基因，qPCR检测处理组表达量显著高于对照组；3个转录组预测下调基因，处理组表达量显著低于对照组。绝大多数候选基因的上调/下调趋势与转录组测序结果保持一致，验证成功率较高。少数低丰度基因Cq偏大，但仪器仍可稳定检出信号，实现低转录本的有效定量。
（四）测序与qPCR结果相关性分析
将转录组log₂FC与qPCR得到的log₂FC进行相关性分析，二者呈现显著正相关。高表达基因一致性更高；部分低丰度转录本存在一定程度偏差，与组学研究普遍报道规律一致，提示低表达基因验证时需要增加生物学重复数量。博清生物荧光定量PCR仪能够准确捕捉1.5倍及以上的表达量变化，适合中等幅度差异基因的筛选验证。
三、讨论
转录组测序可以快速获得海量基因表达信息，但仅依靠测序数据不能直接得出生物学结论，RT‑qPCR 验证是必不可少的金标准手段。qPCR实验结果受RNA质量、引物、反应体系、仪器性能多重因素共同制约，仪器的控温均一性、光学检测稳定性直接决定Cq数据可靠性。
本研究使用博清生物荧光定量PCR仪完成整套差异基因验证实验，仪器表现出良好综合性能：半导体控温保障各孔温度均匀，减少边缘效应；光学检测系统灵敏度高，对中低丰度转录本也能够稳定采集荧光信号；熔解曲线模块可快速判断扩增是否特异，辅助排查引物二聚体、非特异扩增等常见实验问题，降低假阳性结果。配套软件可直接输出Cq、熔解曲线，支持绝对定量计算，简化数据分析流程，适合科研实验室大批量候选基因验证工作。
在实际基因表达差异筛选‑验证工作中，需要注意几点：①不能只选择高表达基因验证，应当兼顾高、中、低丰度基因；②至少选择2个经过验证稳定的内参基因，避免单一内参带来的系统偏差；③设置充足生物学重复与技术重复；④熔解曲线必须纳入常规质控，排除非特异性扩增干扰。
博清生物荧光定量PCR仪既可以完成转录组后续的批量验证，也可直接用于小样本量的基因表达差异筛选，无需依赖高通量测序，适合药物筛选、细胞模型、动植物胁迫、微生物分子生物学等多种研究场景。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪具备优异的控温稳定性、荧光检测灵敏度与孔间重复性，可高效完成转录组来源差异基因的批量验证工作，qPCR结果与转录组测序趋势一致性良好，能够可靠检出上调、下调差异基因，同时通过熔解曲线实现扩增特异性质控。该设备可支撑从候选基因筛选到定量验证的完整基因表达分析流程，为分子生物学、细胞生物学、药物研发等领域的基因表达研究提供稳定可靠的检测平台。
