酶作为生物体内催化生化反应的核心蛋白质，其活性异常与疾病发生、代谢紊乱密切相关，因此酶活性的定量检测在诊断、食品检测、药物筛选及基础生物研究中具有重要意义。传统酶活性检测方法以紫外 - 可见分光光度法为主，通过检测辅酶 NADH 在 340 nm 处的吸光度变化计算酶活性，但该方法灵敏度较低（检出限通常>0.1 U/mL）、样品用量大，且易受背景吸光物质干扰，难以满足微量生物样本（如血清、细胞裂解液）的检测需求。
荧光分析法基于荧光物质的光致发光特性，灵敏度比分光光度法高 10²–10³ 倍，且特异性强、背景干扰小，已成为酶活性检测的主流技术之一。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺/NADH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺/NADPH）是生物体内关键氧化还原辅酶，其中还原型 NADH/NADPH 具有固有荧光特性，在 340 nm 激发光下可发射 460 nm 特征荧光，而氧化型 NAD⁺/NADP⁺无荧光信号。众多脱氢酶（如乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶）催化反应依赖 NAD⁺/NADP⁺作为辅酶，反应过程中氧化型辅酶被还原为 NADH/NADPH，荧光强度随产物生成量线性增加，可直接反映酶活性水平。
博清生物科技（南京）有限公司研发的YQG-01X是一款便携式高灵敏荧光计，具备微量样品检测（1–20 μL）、5 s 快速检测、双通道荧光检测等优势，适配 Qubit 系列试剂及多种荧光探针，广泛应用于核酸、蛋白质定量检测，但在辅酶荧光法酶活性检测中的应用尚未系统报道。
一、材料与方法
（一）仪器与试剂
1、仪器：博清生物 YQG-01X 便携式荧光计；高速冷冻离心机；恒温水浴锅；pH 计。
2、试剂：乙醇脱氢酶（ADH，≥95%）；还原型辅酶 Ⅰ（NADH，≥98%）；氧化型辅酶 Ⅰ（NAD⁺，≥98%）；无水乙醇（分析纯）；Tris-HCl 缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0–9.0）；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ・cm）。
（二）实验方法
1、试剂配制
Tris-HCl 缓冲液：配制 0.1 mol/L Tris 溶液，用 1 mol/L HCl 调节 pH 至 8.0（ADH 最适 pH），4℃保存备用。
NAD⁺溶液：准确称取 NAD⁺粉末，用 Tris-HCl 缓冲液配制成 10 mmol/L 母液，现配现用。
乙醇溶液：用超纯水稀释无水乙醇至 10%（v/v），4℃保存。
ADH 标准溶液：准确称取 ADH 冻干粉，用 Tris-HCl 缓冲液配制成 100 U/mL 母液，梯度稀释为 0.1、0.5、1、2、5、10 U/mL 标准工作液，4℃保存。
2、酶促反应体系构建
总反应体系 20 μL，各组分配比：Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）14 μL、10 mmol/L NAD⁺溶液2μL、10% 乙醇溶液 2 μL、ADH 标准工作液 2 μL；空白对照组用等体积缓冲液替代 ADH 溶液。混匀后置于 37℃恒温水浴孵育 10 min，立即置于冰浴终止反应，待检测。
3、荧光检测
启动博清生物 YQG-01X 荧光计，设置激发波长 340 nm、发射波长 460 nm，预热 5 min。取 20 μL 反应液加入 0.5 mL 透明 PCR 管，放入荧光计检测位，5 s 后读取荧光强度值。每个样品重复检测 3 次，取平均值，扣除空白对照组荧光强度得到净荧光强度。
4、方法学验证
线性关系：以 ADH 活性（0.1–10 U/mL）为横坐标，净荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程与相关系数（R²）。
检出限：以空白对照组荧光强度标准偏差（SD）的 3 倍除以标准曲线斜率，计算检出限（LOD）。
精密度：配制低、中、高 3 种浓度 ADH 样品（0.5、2、5 U/mL），同一天内重复检测 6 次（批内精密度）；连续 6 天检测（批间精密度），计算 RSD。
回收率：向已知活性的血清样品中加入低、中、高 3 种浓度 ADH 标准溶液，检测荧光强度并计算回收率。
二、结果与分析
（一）检测波长优化
NADH 的荧光特性依赖激发与发射波长，波长偏差会导致灵敏度下降、背景干扰增强。本研究固定其他条件，在激发波长 300–380 nm、发射波长 420–500 nm 范围内扫描荧光光谱。结果显示：激发波长 340 nm、发射波长 460 nm 时，NADH 荧光强度最高，背景干扰最小，与文献报道一致。因此确定检测波长为 Ex=340 nm、Em=460 nm。
（二）反应条件优化
1、pH 值优化
ADH 活性对 pH 敏感，过酸或过碱会导致酶蛋白变性失活。在 pH 7.0–9.0 范围内考察 pH 对荧光强度的影响，结果表明：pH 8.0 时荧光强度达到峰值，pH<7.5 或 pH>8.5 时荧光强度显著下降。这与 ADH 最适 pH（7.5–8.5）一致，故选择反应体系 pH 为 8.0。
2、温度优化
温度影响酶促反应速率与荧光效率，低温反应缓慢、荧光信号弱，高温易导致酶失活、荧光猝灭。在25–45℃范围内考察温度对荧光强度的影响，结果显示：37℃时荧光强度最高，温度>40℃时荧光强度快速下降。37℃为人体生理温度，也是多数脱氢酶的最适反应温度，因此选择反应温度为 37℃。
3、底物浓度优化
底物（乙醇、NAD⁺）浓度不足会限制酶促反应速率，浓度过高易产生底物抑制效应。固定 ADH 活性为 5 U/mL，考察不同底物浓度对荧光强度的影响。结果表明：乙醇浓度 1%–2%、NAD⁺浓度 1 mmol/L 时，荧光强度趋于稳定，继续增加底物浓度，荧光强度无明显变化。因此确定乙醇终浓度为 1%、NAD⁺终浓度为 1 mmol/L。
（三）线性关系与检出限
在优化条件下，检测 0.1–10 U/mL ADH 标准溶液的荧光强度，以 ADH 活性（x）为横坐标、净荧光强度（y）为纵坐标绘制标准曲线。结果显示：ADH 活性在 0.1–10 U/mL 范围内与净荧光强度呈良好线性关系，线性回归方程为y=125.6x+18.2，相关系数R2=0.998。以空白对照组标准偏差（SD=0.08）计算，检出限 LOD=3×0.08/125.6=0.02 U/mL，显著低于传统分光光度法，表明该方法灵敏度优异。
（四）精密度验证
对低、中、高 3 种浓度 ADH 样品进行精密度检测。批内 RSD 为 1.2%–2.1%，批间 RSD 为 1.8%–2.9%，均小于 3.0%，表明该方法重复性好、稳定性强，可满足常规检测需求。
（五）回收率验证
向血清样品中加入低、中、高 3 种浓度 ADH 标准溶液，检测回收率。样品加标回收率为 95.2%–102.5%，RSD 为 1.5%–2.8%，表明该方法抗基质干扰能力强，可用于实际生物样品中酶活性的准确检测。
三、讨论
本研究基于 NADH 固有荧光特性，依托博清生物 YQG-01X 荧光计建立酶活性检测方法，相较于传统方法具有显著优势：
（一）高灵敏度：荧光法灵敏度比分光光度法高 10²–10³ 倍，本方法检出限低至 0.02 U/mL，可检测微量酶活性，适用于血清、细胞裂解液等低丰度样本；
（二）微量快速检测：YQG-01X 荧光计仅需 1–20 μL 样品，5 s 即可完成检测，大幅减少样品用量与检测时间，适配高通量检测场景；
（三）操作简便：无需荧光标记探针，直接利用辅酶固有荧光，避免标记过程对酶活性的影响，降低实验成本与操作复杂度；
（四）稳定性强：方法学验证显示精密度与回收率良好，抗基质干扰能力强，可用于复杂生物样品检测。
实验过程中需注意关键控制点：一是 NADH 易被氧化，需现配现用，避光保存；二是荧光强度受温度影响显著，反应与检测过程需严格控制温度；三是生物样本中可能存在自发荧光物质，需设置空白对照组扣除背景干扰，确保结果准确性。
本研究以 ADH 为模型酶验证方法可行性，该原理可推广至所有依赖 NAD⁺/NADP⁺为辅酶的脱氢酶（如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶）活性检测。后续可进一步优化反应体系，拓展至多酶同步检测，结合 YQG-01X 荧光计双通道特性，实现不同酶活性的并行分析，提升检测效率。
本研究成功建立基于博清生物科技（南京）有限公司研发的YQG-01X荧光计的辅酶荧光法酶活性检测方法，优化了激发/发射波长、pH、温度及底物浓度等关键参数。方法学验证表明，该方法线性范围宽、灵敏度高、精密度好、回收率稳定，兼具微量样品、快速检测的优势，解决了传统方法灵敏度低、样品用量大的问题。该方法操作简便、成本低廉，为生物化学研究、诊断及药物筛选中酶活性的精准检测提供了可靠技术方案，同时拓展了博清生物YQG-01X荧光计的应用场景。
