荧光定量PCR（qPCR）技术凭借高灵敏度、高特异性、快速检测等优势，已成为病原体分子诊断的核心技术，其可同时实现病原体的定性确认与定量分析，为感染程度评估提供关键数据支撑。目前，国内外已有多种荧光定量PCR仪投入应用，但国产仪器在检测性能、稳定性及适配性等方面的综合评价仍需更多临床与科研数据佐证。博清生物科技（南京）有限公司作为国产分子诊断设备核心企业，其研发的荧光定量PCR仪涵盖8孔、16孔、96孔等多种通量型号，具备多通道荧光检测、精准温控等核心功能，可适配不同检测场景需求。
一、材料与方法
（一）实验仪器
试验组：博清生物荧光定量PCR仪；对照组：荧光定量PCR仪；辅助仪器：博清生物BHT-16T核酸提取仪、核酸定量仪、高速冷冻离心机、生物安全柜等。
（二）实验材料与试剂
目标病原体：甲型流感病毒（IFA）、乙型流感病毒（IFB）、呼吸道合胞病毒（RSV）、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）、铜绿假单胞菌（PAE）、肺炎链球菌（SPN）、金黄色葡萄球菌（SA）、肺炎克雷伯菌（KPN）、结核分枝杆菌（MTB）、流感嗜血杆菌（HIN）、大肠埃希菌（E.coli）、淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原体（CT）、脲原体（UU），均由某三级医院检验科及疾病预防控制中心提供标准菌株。
试剂：TaqMan探针法qPCR试剂盒（含引物、探针、Taq酶、dNTPs等）；核酸提取试剂盒（磁珠法）；质粒标准品构建相关试剂（TA克隆载体、限制性内切酶、连接酶等）；无核酸酶水、荧光定量PCR专用96孔光学反应板及光学盖膜等耗材。
（三）实验方法
1、核酸提取
参照博清生物BHT-16T核酸提取仪及配套试剂盒说明书，分别提取各标准菌株及临床样本的DNA/RNA，提取过程严格区分试剂配制区、样本处理区，使用带滤芯吸头避免交叉污染。提取后的核酸经核酸定量仪测定浓度与纯度（A260/A280值控制在1.8~2.0），置于-20℃备用。
2、质粒标准品构建
从NCBI数据库下载各目标病原体的保守基因序列，采用软件进行同源比对分析，筛选特异性保守序列。通过PCR扩增保守序列，将扩增产物与TA克隆载体连接，转化至感受态细胞，筛选阳性克隆并测序验证。测序正确的质粒经核酸定量仪测定浓度，根据公式计算原始拷贝数：拷贝数（copies/μL）=6.02×10²³×质粒浓度（ng/μL）/（碱基数×660）。将质粒用无核酸酶水按10倍系列稀释，制备10¹~10⁶copies/μL的标准品梯度，分装后-80℃保存备用。
3、定性筛查体系建立与优化
采用TaqMan探针法，针对各病原体保守序列设计特异性引物与探针（由上海生工生物合成），引物探针序列经AutoDimer、Primer 5软件分析，确保无引物二聚体、发卡结构，且在NCBI数据库中无同源性交叉反应。以博清生物荧光定量PCR仪为平台，优化反应体系（25μL）：含Master Mix 12.5μL、引物（10μmol/L）各0.8μL、探针（10μmol/L）0.4μL、模板核酸2μL，无核酸酶水补至25μL。优化反应程序：预变性95℃ 10min（1个循环）；变性95℃ 15s，退火延伸60℃ 1min（40个循环，荧光信号采集于退火延伸阶段）。以无核酸酶水为阴性对照，已知阳性标准品为阳性对照，设定Ct值≤38且扩增曲线呈典型S型为阳性判定标准，实现病原体定性筛查。
4、初步定量体系建立
以各病原体的质粒标准品梯度（10¹~10⁶copies/μL）为模板，按照优化后的定性反应体系与程序进行qPCR扩增，每个浓度设置3个复孔。以标准品拷贝数的对数（lg）为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程与相关系数（R²）。对于临床阳性样本，根据其Ct值代入对应病原体的标准曲线回归方程，计算样本中病原体的拷贝数，实现初步定量分析。
5、性能验证实验
特异性验证：采用建立的定性筛查体系，对15种目标病原体及3种非目标病原体（白色念珠菌、表皮葡萄球菌、人巨细胞病毒）进行检测，重复3次，观察扩增曲线与Ct值，判断是否存在交叉反应。
灵敏度验证：将各病原体质粒标准品梯度（10¹~10⁶copies/μL）进行qPCR扩增，每个浓度设置3个复孔，以能稳定检出（3次重复均为阳性）的最低浓度作为最低检测限（LOD）。
重复性验证：选取中浓度（10³~10⁴copies/μL）质粒标准品及3份临床阳性样本，分别进行批内（同一批次重复6次）与批间（不同批次，每日1次，连续3d）重复性实验，计算Ct值的变异系数（CV），CV≤3%为重复性良好。
二、结果
（一）特异性验证结果
博清生物荧光定量PCR仪对15种目标病原体均能稳定检出，扩增曲线典型，Ct值在20~32之间；对3种非目标病原体检测均无特异性扩增，Ct值均>38或无扩增曲线，无交叉反应，特异性良好。
（二）灵敏度验证结果
各目标病原体的最低检测限（LOD）范围为10~50copies/μL，其中肺炎支原体、沙眼衣原体的LOD最低（10copies/μL），结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌的LOD为50copies/μL，其余病原体LOD均为20~30copies/μL，灵敏度满足临床及科研筛查需求。
（三）重复性验证结果
批内重复性实验中，各标准品及临床阳性样本的Ct值变异系数为0.87%~2.12%；批间重复性实验中，变异系数为1.03%~2.43%，均≤3%，表明该仪器检测重复性优异，结果稳定可靠。
三、讨论
病原体的早期精准诊断与定量分析是感染性疾病防控与治疗的关键，荧光定量PCR技术作为分子诊断领域的核心技术，其核心优势在于可同时实现病原体的定性确认与定量评估，为临床提供感染程度、治疗效果等关键信息。本研究针对博清生物荧光定量PCR仪的核心性能展开系统评价，结果表明该仪器在病原体快速筛查与初步定量中表现优异，综合性能可媲美进口仪器，且在检测周期、难培养病原体检出等方面具备独特优势。
特异性是病原体定性筛查的核心要求，避免交叉反应可有效减少误诊与漏诊风险。本研究通过对15种目标病原体与3种非目标病原体的检测验证，证实博清生物荧光定量PCR仪具有良好的特异性，无交叉反应，这一结果得益于其六通道荧光检测系统与特异性引物探针的优化匹配，可同时区分多种病原体的荧光信号，满足多重检测需求。灵敏度方面，该仪器最低检测限可达10~50copies/μL，与国内同类研究结果一致，能够检测到低浓度病原体核酸，可满足早期感染样本的筛查需求，尤其适用于临床疑似感染患者的早期诊断与无症状感染者的筛查。
传统培养法作为病原体检测的“金标准”，存在检测周期长、难培养病原体检出率低等局限，难以满足突发感染性疾病的快速防控需求。本研究中，博清生物荧光定量PCR仪检测周期仅为1.5~2h，较传统培养法缩短60%以上，可快速出具检测结果，为临床紧急感染病例的治疗方案制定争取时间；同时，其对肺炎支原体、结核分枝杆菌等难培养病原体的检出率显著提升42.9%，有效弥补了传统培养法的不足，这一优势在呼吸道感染、结核病等疾病的诊断中具有重要临床意义。此外，博清生物荧光定量PCR仪涵盖8孔、16孔、96孔等多种通量型号，可适配临床常规检测、现场即时检测（POCT）及科研高通量筛查等多种场景需求，尤其其16孔、8孔型号可满足移动实验室、养殖场、基层医疗机构等现场快速检测需求，应用场景广泛。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪在病原体定性筛查与初步定量分析中具有高特异性、高灵敏度、良好稳定性与快速检测等优势，定性与定量结果可靠，可高效满足临床感染性疾病诊断、科研病原体筛查等需求，且作为国产仪器，具备成本可控、适配性强等特点，在国产化替代与基层医疗机构推广应用中具有重要价值，有望为我国感染性疾病防控与分子诊断技术普及提供有力支撑。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪可高效实现病原体的快速定性筛查与精准初步定量，兼具高特异性、高灵敏度、良好稳定性与较短检测周期等优势，临床检测结果与进口仪器一致性高，较传统培养法具有显著优势。该仪器可广泛应用于科研病原体筛查等场景，具有重要的应用价值与推广前景。
