基因敲除（Gene Knockout, KO）通过靶向修饰基因组，使特定基因功能丧失，是反向遗传学研究的核心技术。随着 CRISPR/Cas9 技术的普及，基因敲除已广泛应用于肿瘤、发育生物学、神经科学等领域，但基因功能缺失常伴随细胞增殖、代谢、凋亡等表型改变，其中细胞活力是最直观、最基础的评价指标 —— 既反映基因对细胞存活的必要性，也关联后续功能实验的可行性。
细胞活力检测常用 MTT、CCK-8、ATP 发光法等，均依赖酶标仪实现定量检测。传统酶标仪存在灵敏度不足、检测模式单一、通量低等缺陷，难以满足基因敲除研究中多组学、大样本、高精度需求。博清生物科技（南京）有限公司研发的微孔板酶标仪，集成吸光度、荧光、化学发光多检测模式，搭载线性 PMT 检测技术与双激发光源补偿系统，兼具高灵敏度、宽动态范围与高通量优势。
一、材料与方法
（一）实验材料
细胞株：野生型 PK-15 细胞（WT）、CRISPR/Cas9 介导的 HO-1 基因敲除单克隆细胞（KO），由实验室构建并经测序、Western blot 验证。
主要试剂：CCK-8 试剂盒、DMEM 高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、氯化镉。
主要仪器：博清生物能酶标仪、细胞培养箱、超净工作台、低速离心机。
（二）实验方法
1、细胞培养
WT 与 KO 细胞均用含 10% 胎牛血清、1% 双抗的 DMEM 培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱培养；取对数生长期细胞用于实验，每 2-3 天传代 1 次，确保细胞状态稳定。
2、基因敲除细胞模型验证
采用 Sanger 测序检测靶基因区域碱基缺失/插入突变，Western blot 检测 HO-1 蛋白表达，确认基因完全敲除且无脱靶效应。
3、细胞活力检测（CCK-8 法）
细胞接种：将 WT 与 KO 细胞消化、计数，以5×10³个/孔接种于96孔板，每孔培养基100μL，每组设6个复孔，同时设空白对照组（仅加培养基，无细胞）。
分组处理：常规培养 24h 细胞贴壁后，分为对照组（正常培养）、CdCl₂处理组（加入 10μmol/L CdCl₂模拟应激环境），继续培养48h。
CCK-8染色：每孔加入10μL CCK-8试剂，轻轻晃动96孔板混匀，置于37℃培养箱避光孵育1.5h。
吸光度检测：采用博清生物酶标仪，设定检测波长450nm，参比波长630nm（双波长检测消除非特异性干扰），读取每孔OD值。
二、结果
（一）HO-1基因敲除细胞模型验证
测序结果显示，KO细胞HO-1基因出现碱基缺失与移码突变；Western blot检测未发现HO-1蛋白表达，证实HO-1基因完全敲除，模型构建成功。
（二）基因敲除对常规培养下细胞活力的影响
常规培养条件下，WT 组与KO组细胞存活率无显著差异（P>0.05）。WT组OD₄₅₀值为 1.28±0.07，KO组为1.23±0.06，表明HO-1基因敲除不影响细胞基础活力与增殖能力。
（三）应激条件下基因敲除对细胞活力的影响
10μmol/L CdCl₂处理48h后，两组细胞活力均显著降低，但KO组下降更明显：WT组存活率为68.3±4.2%，KO组仅为35.7±3.5%，差异极显著（P<0.01）。结果表明，HO-1基因在细胞应对镉应激时发挥关键保护作用，基因敲除会显著削弱细胞抗逆能力，降低应激状态下的细胞活力。
（四）博清酶标仪检测性能验证
高灵敏度：可精准区分两组细胞OD值微小差异，变异系数（CV）<3%，远低于传统酶标仪（CV>5%）；
高通量高效：单次可检测1块96孔板，8通道同步检测，10s内完成全板读数，适配大样本实验；
数据稳定：双波长检测有效扣除背景干扰，6复孔数据一致性好，内置质控功能确保结果可靠。
三、讨论
基因敲除的核心目的是解析基因功能，而细胞活力是判断基因是否为细胞必需基因、是否参与应激响应的核心表型。本研究选择HO-1基因为靶点，其编码的血红素氧合酶 - 1是细胞抗氧化、抗应激的关键蛋白，在重金属、氧化损伤等应激中发挥保护作用。结果显示，常规条件下HO-1敲除不影响细胞活力，说明该基因非细胞基础存活必需；但镉应激下KO细胞活力急剧下降，证实其在应激保护中的核心功能——这与现有研究结论一致，也验证了本检测体系的可靠性。
博清生物酶标仪在本研究中展现出显著技术优势：
多模式兼容：除吸光度外，还支持荧光、化学发光检测，可同步开展细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI）、ATP含量、ROS水平等多指标检测，满足基因敲除后多表型分析需求；
高精度检测：线性PMT技术与双光源补偿确保低浓度样本信号精准，双波长检测有效消除细胞碎片、培养基浊度等干扰，解决传统酶标仪“假阳性、假阴性”问题；
高通量适配：96孔板整板快速检测，搭配内置数据处理软件，可自动计算存活率、IC₅₀等参数，大幅提升基因敲除筛选、药物毒性评估等高通量实验效率；
操作便捷：全中文操作界面，支持数据存储、导出与质控追溯，符合实验室数字化管理需求。
对比传统检测方法（如显微镜计数、MTT法），博清酶标仪结合CCK-8法具有操作简便、重复性好、灵敏度高、无毒性等优势——CCK-8产物水溶性强，无需DMSO溶解，减少操作误差；检测线性范围宽，适配不同密度细胞样本，尤其适合基因敲除后细胞活力微弱变化的精准定量。
四、结论
HO-1基因敲除不影响PK-15细胞基础活力，但显著降低镉应激下的细胞存活率，证实HO-1是细胞抗应激关键基因；
博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪凭借高灵敏度、高通量、多模式、易操作等特性，可精准、高效检测基因敲除后细胞活力变化，为基因功能研究、细胞模型构建、药物筛选提供可靠技术平台；
酶标仪结合CCK-8比色法是基因敲除细胞活力检测的优选方案，适用于各类真核细胞基因敲除表型的快速、定量评价。
随着基因编辑技术发展，单基因、多基因、条件性敲除模型日益增多，对细胞表型检测的精准度、通量、维度提出更高要求。博清生物酶标仪可进一步拓展时间分辨荧光（TRF）、荧光偏振（FP）等功能，实现基因敲除后蛋白互作、信号通路、代谢组学的一体化检测。未来结合单细胞测序、高内涵成像技术，将构建“基因编辑 - 表型检测 - 机制解析”全链条研究体系，推动基因功能研究向更精准、更系统、更高效方向发展。
