荧光染料法凭借特异性荧光染料与dsDNA的选择性结合特性，有效克服了紫外分光光度法的缺陷，具有更高的灵敏度和特异性。其中，dsDNA HS检测试剂盒采用的Picogreen类荧光染料可特异性结合dsDNA的小沟区域，结合后荧光强度显著增强，且不与RNA、蛋白质、盐离子等杂质结合，能够精准反映样品中dsDNA的真实浓度。博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计作为一款专用于核酸与蛋白定量的检测仪器，具备操作简便、检测快速、数据稳定等特点，但其在dsDNA定量中的具体应用效能、线性范围、抗干扰能力等关键指标尚未得到系统评估。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器：博清生物荧光计；紫外分光光度计；高速冷冻离心机；涡旋振荡器；移液器；0.5mL薄壁离心管；96孔黑色平底酶标板。
2、试剂与样品： dsDNA HS检测试剂盒，含dsDNA HS试剂、dsDNA HS缓冲液、标准品#1（0ng/μL）、标准品#2（10ng/μL）；缓冲液（100×）；小牛血清白蛋白（纯度≥98%）；酵母RNA（纯度≥98%）；基因组dsDNA（提取自人外周血白细胞，纯度经检测A260/A280=1.85~1.90）。
（二）实验方法
1、工作液制备
根据dsDNA HS检测试剂盒说明书，制备工作液：取60μL dsDNA HS试剂与11.94mL dsDNA HS缓冲液充分混匀，配制12mL工作液，现配现用，2~8℃避光保存。
2、标准品梯度制备
以1×TE缓冲液为稀释液，将Qubit dsDNA HS标准品#2（10ng/μL）进行梯度稀释，制备浓度为10pg/μL、50pg/μL、100pg/μL、500pg/μL、1ng/μL、10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL的系列标准品溶液，每个浓度设置3个重复孔。
3、样品制备
纯dsDNA样品 取提取的人外周血白细胞基因组dsDNA，用1×TE缓冲液稀释至5ng/μL、20ng/μL、80ng/μL三个浓度，每个浓度设置3个重复。
含杂质dsDNA样品 分别在5ng/μL、20ng/μL、80ng/μL的纯dsDNA样品中加入RNA（终浓度5ng/μL）和BSA（终浓度10μg/μL），制备含RNA+蛋白质杂质的混合样品，每个浓度设置3个重复，用于评估仪器的抗干扰能力。
4、检测流程优化与实施
取0.5mL薄壁离心管，分别标记标准品、纯样品、杂质样品编号。向每个标准品管中加入190μL工作液和10μL系列标准品溶液，涡旋混匀（2~3s），避免产生气泡；向每个样品管中加入195μL工作液和5μL待测样品（终体积200μL），涡旋混匀后短暂离心（3000r/min，1min）去除气泡。将所有反应管置于室温避光孵育，分别设置孵育时间2min、3min、5min，通过比较不同孵育时间下标准品的荧光强度稳定性，确定最优孵育时间。
将优化孵育时间后的反应管放入博清生物荧光计样品槽，按照仪器操作流程进行检测：开机后选择“DNA检测”模式，进入“dsDNA High Sensitivity”检测程序，先放入标准品#1（0ng/μL）和标准品#2（10ng/μL）进行校准，校准完成后依次检测系列标准品和待测样品，记录每个样品的荧光强度及计算得到的浓度值。同时，将所有待测样品用紫外分光光度计在260nm波长下检测吸光度，计算浓度值作为对照。
5、重复性实验
选取20ng/μL的纯dsDNA样品和含杂质dsDNA样品，按照上述最优检测流程进行重复检测，每天检测3次，连续检测3 d，记录每次检测的浓度值，计算相对标准偏差（RSD），评估仪器检测的稳定性。
二、结果
（一）孵育时间优化结果
不同孵育时间对dsDNA-荧光染料结合体系荧光强度的影响结果显示：孵育2 min时，系列标准品的荧光强度尚未达到稳定；孵育3 min时，各浓度标准品的荧光强度趋于稳定，且重复性良好（RSD<2%）；孵育5 min时，荧光强度无显著提升（P>0.05）。因此，确定最优孵育时间为3min。
（二）线性范围与灵敏度
以系列标准品浓度（x轴）为自变量，对应的荧光强度（y轴）为因变量进行线性回归分析，结果显示：在10pg/μL~100ng/μL浓度范围内，博清生物荧光计检测的荧光强度与dsDNA浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y=25.32x+12.47，相关系数R²=0.998。仪器最低检测限（LOD）为10pg/μL，低于紫外分光光度计的最低检测限（5ng/μL）。
（三）纯dsDNA样品定量结果比较
博清生物荧光计检测结果与理论浓度偏差较小（1.2%~3.5%），而紫外分光光度计检测结果偏差相对较大（4.8%~7.2%）。统计学分析显示，两种方法在5ng/μL、20ng/μL、80ng/μL三个浓度下的检测结果存在显著差异（P<0.05），博清生物荧光计定量结果更接近理论值。
（四）杂质干扰实验结果
博清生物荧光计在各浓度杂质样品中的定量结果偏差均小于5%（2.1%~4.7%），与纯样品检测结果无显著差异（P>0.05）；而紫外分光光度计在杂质样品中的定量结果偏差显著增大（15.3%~27.8%），且浓度越低，偏差越大，表明其易受RNA和蛋白质杂质的干扰。
（五）重复性实验结果
重复性实验显示，博清生物荧光计对20ng/μL纯dsDNA样品和含杂质dsDNA样品的检测结果RSD分别为2.1%和2.8%，均小于3%，表明仪器具有良好的检测稳定性，检测结果可靠。
三、讨论
dsDNA的精准定量是分子生物学实验的基础，低浓度、高杂质样品的定量准确性一直是行业内的技术难点。本研究系统评估了博清生物荧光计在dsDNA定量中的应用效能，结果表明该仪器结合dsDNA HS检测试剂盒，在线性范围、灵敏度、特异性及稳定性等方面均表现出优异性能，能够有效满足精密实验对dsDNA定量的需求。
线性范围和灵敏度是评估定量仪器性能的核心指标。本研究发现，博清生物荧光计在10pg/μL~100ng/μL浓度范围内对dsDNA的定量具有良好的线性关系（R²>0.995），最低检测限可达10pg/μL，显著优于紫外分光光度计（最低检测限5ng/μL）。这一优势使得博清生物荧光计能够精准定量低浓度dsDNA样品，如PCR产物、病毒DNA等，而这类样品采用紫外分光光度法往往难以获得可靠结果。其高灵敏度主要源于荧光染料与dsDNA的特异性结合机制：荧光染料在未结合dsDNA时荧光强度极低，结合后通过构象变化激活荧光信号，使得荧光强度与dsDNA浓度呈良好的剂量依赖关系，从而实现低浓度样品的精准检测。
特异性和抗干扰能力是保障dsDNA定量准确性的关键。紫外分光光度法基于260nm波长吸光度检测，无法区分dsDNA与RNA、蛋白质等杂质，导致含杂质样品的定量结果偏差较大。本研究中，紫外分光光度计在含RNA和蛋白质的样品中定量偏差达15.3%~27.8%，而博清生物荧光计的偏差仅为2.1%~4.7%，表明其具有极强的抗干扰能力。这一结果与dsDNA HS试剂的特异性密切相关，其采用的荧光染料仅与dsDNA的小沟区域结合，不与RNA、蛋白质、盐离子等常见杂质作用，从而有效排除了杂质对定量结果的干扰，能够真实反映样品中dsDNA的实际浓度。
重复性实验结果显示，博清生物荧光计检测结果的RSD均小于3%，表明仪器性能稳定，检测数据可靠。此外，该仪器操作简便，检测快速，单个样品检测时间仅需3~5s，且样品需求量少（1~20μL），能够有效减少样品损耗，提高实验效率，适合高通量样品检测需求。与传统紫外分光光度计相比，博清生物荧光计无需复杂的样品前处理，仅需简单的孵育步骤即可进行检测，降低了实验操作难度和人为误差，更适合常规实验室的日常应用。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计结合特异性荧光染料法，在dsDNA定量中具有线性范围宽、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便等优势，能够有效克服传统紫外分光光度法的缺陷，为后续qPCR、NGS、基因克隆等精密实验提供精准的定量数据支持，具有重要的实用价值和推广前景。
