蛋白质磷酸化修饰由激酶‑磷酸酶系统协同调控，通过对蛋白丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸位点共价结合磷酸基团，改变靶蛋白空间构象与生物活性，介导胞外信号向胞内传递，调控细胞周期、免疫应答、肿瘤恶性转化等生理病理过程。磷酸化ERK、AKT、STAT等标志性蛋白是研究MAPK、PI3K/Akt、JAK‑STAT通路激活程度的核心标志物，精准定量其磷酸化水平， 是解析细胞功能表型背后分子机制的基础实验手段。
目前磷酸化蛋白主流检测手段中，蛋白质免疫印迹法（Western Blot）为半定量方法，流程耗时，样本需求量高，批次间偏差大；ELISA可实现定量，但孵育洗涤步骤多；质谱磷酸化组学通量高但成本昂贵，不适合常规样本批量验证。基于荧光探针与特异性磷酸化抗体的荧光检测技术，凭借信号稳定、动态范围宽、样品用量少的优势，逐渐成为细胞磷酸化分析重要方向。博清生物科技（南京）有限公司研发的YQG‑01X荧光计为双通道便携式荧光检测设备，仅需1‑20 μL微量样本，5 s完成检测，适配通用荧光检测试剂，兼顾检测灵敏度与操作便捷性。
一、材料与方法
（一）仪器与试剂
博清生物YQG‑01X荧光计；细胞培养箱；高速冷冻离心机；多功能酶标仪（对照仪器）；蛋白定量试剂盒；磷酸化ERK特异性荧光标记抗体、总ERK抗体；RIPA细胞裂解液；蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物；PBS 缓冲液；BCA蛋白定量试剂盒；标准磷酸化蛋白梯度品；HeLa细胞、HepG2细胞。
（二）细胞样本制备
培养 HeLa 细胞，设置对照组与 EGF 刺激处理组，刺激完成后弃培养基，预冷 PBS 清洗，加入含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液冰上裂解，离心收集上清，BCA 测定总蛋白浓度，将各组细胞裂解样本统一稀释至相同总蛋白浓度备用。制备梯度稀释的重组磷酸化 ERK 标准品，用于标准曲线构建。
（三）荧光标记检测体系构建
采用免疫荧光标记体系：取10‑15 μL标准品或细胞裂解样本，加入荧光基团标记的磷酸化位点特异性抗体与总蛋白抗体，避光孵育，完成抗原‑抗体特异性结合。体系设置空白对照、阴性对照，消除游离荧光探针与细胞裂解基质背景荧光干扰。
（四）博清生物荧光计检测流程
吸取孵育完成的反应体系1‑20 μL，加入0.5 mL透明PCR管，放置于博清生物YQG‑01X荧光计样品槽，选择对应荧光检测通道，5 s读取荧光信号值。以标准品浓度为横坐标，荧光信号强度为纵坐标绘制标准曲线，计算样品中磷酸化蛋白含量；以磷酸化蛋白信号/总蛋白信号比值表征通路激活水平，消除上样量差异带来的实验误差。
（五）方法学评价
1、线性关系：对梯度磷酸化蛋白标准品检测，计算线性相关系数R²；
2、灵敏度：确定最低检出限LOD与定量限LOQ；
3、重复性：同一样本设置6个平行，计算变异系数CV；
4、样本比对：将荧光计检测结果与传统Western Blot、多功能酶标仪检测结果进行比对，验证方法可靠性。
二、实验结果
（一）标准曲线与线性范围
博清生物荧光计检测磷酸化蛋白标准品，在0.05‑5 ng/μL 浓度区间荧光信号与蛋白浓度具备良好线性关系，R²＞0.992，可覆盖细胞裂解样本中磷酸化蛋白常见浓度区间，能够满足细胞信号通路基础研究的定量需求。最低检出限可达 0.02 ng/μL，可检测低丰度磷酸化修饰蛋白，适配原代细胞、少量细胞收获的微量样本检测。
（二）重复性实验结果
同一细胞裂解样本6次平行检测，荧光信号变异系数CV＜4.2 %，仪器检测重复性良好；批间重复实验CV＜6 %，证明博清生物荧光计在磷酸化蛋白荧光定量中结果稳定，降低微量样本检测随机误差。
（三）细胞样本检测结果
EGF刺激HeLa细胞后，MAPK通路激活，磷酸化ERK蛋白水平显著升高。博清生物荧光计检测结果显示刺激组p‑ERK/总ERK比值较对照组显著上调，变化趋势与Western Blot灰度分析、酶标仪检测结果高度一致。相比传统实验手段，本方案样本用量仅十几微升，整体检测时长缩短，无需转膜、洗膜等繁琐步骤，适合药物梯度处理、多时间点动力学样本批量检测，便于观察细胞受刺激后磷酸化蛋白随时间动态波动，解析细胞应答时序特征。
（四）基质干扰考察
细胞裂解液内细胞碎片、杂蛋白会带来微弱背景荧光，通过设置空白裂解基质对照，可有效扣除背景干扰，不影响目标磷酸化蛋白定量结果，适合复杂胞内裂解样本直接检测。
三、讨论
细胞功能研究中，磷酸化蛋白检测核心痛点在于：很多实验条件下细胞收获量有限，磷酸化蛋白属于低丰度修饰蛋白；传统实验方法耗时长，很难完成多时间点、多药物浓度条件的样本分析。博清生物YQG‑01X荧光计以微量进样、快速读数、双通道检测的特点，适配磷酸化蛋白荧光免疫检测体系，弥补传统手段不足。相较于大型微孔板荧光检测设备，该荧光计体积小巧，无需微孔板，使用普通PCR管即可完成检测，节省试剂，适合中小型科研实验室开展细胞信号通路研究。
该检测方案可拓展应用于多种细胞功能方向：肿瘤细胞激酶通路活化评估、免疫细胞细胞因子刺激后STAT蛋白磷酸化检测、药物化合物对细胞激酶‑磷酸酶网络调控效应评价、基因编辑后细胞信号分子修饰水平验证。对于珍贵原代细胞、干细胞等样本，微量样本检测能力可以极大节约实验材料。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计可应用于细胞裂解样本磷酸化蛋白荧光定量检测，该方法灵敏度良好、线性范围合适、重复性稳定，样本消耗量低，操作流程简便，检测结果与经典检测方法趋势一致。可以用于细胞信号转导、细胞功能机制、药物细胞效应评价等科研工作，为磷酸化蛋白相关细胞生物学研究提供一套经济便捷的定量检测方案，作为传统Western Blot、酶标检测技术的有效补充。
