基因表达的转录水平变化是细胞应答外界刺激、疾病发生发展、药物作用调控的核心分子特征。RT‑qPCR 凭借灵敏度高、通量灵活、检测快速的优势，成为验证转录组测序结果、分析基因上调/下调表达的金标准方法。qPCR 定量分为绝对定量与相对定量，相对定量侧重于组间表达倍数差异，通过稳定表达的内参基因校正 RNA 提取、反转录、加样带来的系统误差，对比对照组与处理组样本目的基因转录水平变化，在生命科学各领域应用最为普遍。
相对定量结果高度依赖仪器温控一致性、荧光信号采集稳定性、引物扩增效率以及内参基因的可靠性。博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪搭载动态精准温控模块与多通道光学检测系统，支持SYBR Green染料法与TaqMan探针法，内置相对定量分析模块，适配细胞、动物组织、植物组织等多种样本来源的基因表达检测场景。
一、材料与仪器
（一）实验样本
人源细胞系、动物组织样本；分为空白对照组与药物/刺激处理组，每组设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复。
（二）主要试剂
总RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、SYBR Green qPCR预混液；目的基因引物、内参基因引物（GAPDH、β‑Actin，根据样本类型预验证内参稳定性）；无核酸酶水。
（三）仪器设备
博清生物荧光定量PCR仪；超纯水机；核酸提取仪；高速冷冻离心机；微量移液器；核酸浓度检测仪。
仪器核心性能：自主动态精准温控技术，温度准确性≤±0.1 ℃，模块均一性优异，降低孔间扩增偏差；多通道LED光源搭配高灵敏光电检测单元，支持FAM/SYBR‑Green、HEX/VIC、ROX、Cy5等常见荧光；软件集成扩增曲线、熔解曲线分析、相对定量2<sup>‑ΔΔCt</sup>自动计算、扩增效率评估功能，支持独立阈值设置，无需外接电脑即可完成基础数据分析输出报告。
二、实验方法
（一）RNA 提取与 cDNA 合成
收集各组细胞或组织，按照试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA浓度与A260/A280比值，比值控制在1.8‑2.1，保证RNA完整性。取等量总RNA进行反转录，合成第一链cDNA，cDNA样本‑20 ℃保存备用。
（二）PCR 扩增程序设置
1、预变性：95 ℃，30 s；
2、扩增循环（40 循环）：95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；每循环结束采集荧光信号；
3、熔解曲线程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，缓慢升温至 95 ℃，连续采集荧光，用于判断扩增产物特异性，排除引物二聚体与非特异性扩增干扰PMC。
（三）相对定量计算原理（2<sup>‑ΔΔCt</sup>法）
Livak‑2<sup>‑ΔΔCt</sup>法是相对定量主流算法，该方法成立前提：目的基因与内参基因扩增效率均处于 90%‑110%，两者扩增效率差值小于 5%；实验处理不会改变内参基因表达水平。
计算公式：
ΔCt = 目的基因 Ct‑内参基因 Ct
ΔΔCt = 处理组 ΔCt −对照组 ΔCt
相对表达倍数 = 2<sup>‑ΔΔCt</sup>
当扩增效率偏差较大时，可切换Pfaffl效率校正公式开展计算，博清生物qPCR软件支持导入扩增效率进行校正计算。对照组样本作为校准样本，其基因相对表达量定义为1。
（四）实验质控标准
1、Ct有效区间控制15‑35，Ct＞35视为低丰度模板，结果可信度下降；
2、熔解曲线呈现单一尖锐峰，无杂峰，证明无非特异性扩增；
3、技术重复Ct差值＜0.5，保证仪器检测重复性；
4、生物学重复3组以上，后期开展统计学差异分析。
三、结果与分析
（一）扩增曲线与熔解曲线质量评估
博清生物荧光定量PCR仪实时采集荧光信号，扩增曲线呈现典型S型，基线平稳、指数扩增区间清晰，阈值线设置于指数扩增期。熔解曲线全部为单一特异峰，无引物二聚体杂峰，说明引物特异性良好，Ct值数据有效，可用于后续相对定量计算。孔间温度均一性保障不同八联管样本扩增条件一致，降低系统误差。
（二）基因相对表达定量结果
导出仪器原始Ct数据，分别计算每组样本ΔCt、ΔΔCt，得到目的基因在处理组相对对照组的表达倍数。例如，药物刺激后，目的基因相对表达量为3.21，代表基因上调约3.21 倍；相对表达量0.26，代表基因下调。
软件可直接输出相对表达柱状图，结合生物学重复数据开展 t 检验或者方差分析，判断组间基因表达差异是否具有统计学意义（P＜0.05）。
（三）关键影响因素讨论
1、内参基因选择：不可直接固定选用GAPDH、β‑Actin，需要针对本实验模型验证内参稳定性，处理条件会造成部分管家基因表达波动，直接带来定量结果错误，条件允许建议采用2个及以上内参基因联合校正PMC。
2、扩增效率验证：使用cDNA梯度稀释制作标准曲线，计算扩增效率。若效率偏离90‑110%，需要重新优化引物，不建议直接使用2<sup>‑ΔΔCt</sup>法。博清仪器软件可直接生成标准曲线，计算扩增效率与 R²，方便快速评估实验体系。
3、样本与 RNA 质量：RNA 降解、样本存在蛋白、乙醇等 PCR 抑制剂，会直接造成 Ct 偏移，出现假上调或假下调。
4、仪器硬件层面：温控不均、荧光信号漂移会增大Ct重复误差。博清生物qPCR仪依靠精准帕尔贴温控与高灵敏光学检测，有效减少孔间差异，保障相对定量重复性。
四、应用拓展
基于博清生物荧光定量PCR仪开展的相对定量技术，适用广泛科研方向：
（一）细胞药理：药物干预后靶基因、通路基因mRNA表达差异分析；
（二）医学研究：疾病组织‑对照组织之间基因表达比较，挖掘疾病标志物；
（三）植物与微生物：胁迫条件下抗性基因、代谢基因表达解析；
（四）组学验证：转录组测序后大批量候选基因qPCR验证工作。
同时仪器兼容探针法，适合低丰度基因、同源序列基因的高特异性相对定量检测。
相对定量2<sup>‑ΔΔCt</sup>分析是解析基因转录水平差异的重要手段，实验结果是样本前处理、引物体系、仪器性能、数据分析规范共同决定。博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪凭借精准温控、稳定的荧光采集性能，搭配内置完整相对定量分析软件，可输出可靠Ct原始数据，完成熔解曲线质控、扩增效率评估与表达倍数计算。严格遵守实验规范，做好RNA质控、内参验证、扩增效率校验，能够获得稳定可信的基因相对表达结果，服务细胞分子机制、药理毒理、疾病分子生物学等相关科学研究。
