细胞活性直接反映细胞线粒体代谢、胞内酯酶活性、细胞膜完整度三大核心生理功能，是细胞凋亡、药物细胞毒性、炎症刺激、生物材料相容性研究的基础检测终点。传统比色法 MTT、CCK-8 依赖可见光吸光度检测，存在灵敏度低、高细胞密度信号饱和、无法区分活/死细胞群体、难以实现多指标同步检测等局限；ATP 发光法裂解细胞，无法开展活细胞连续动态监测；流式细胞仪操作繁琐、检测通量低，不适用于大规模药物初筛。
荧光定量检测依托特异性活细胞荧光探针，以荧光分光/微孔荧光计采集信号，可通过代谢活性、细胞膜通透性双维度评价细胞状态，兼具高灵敏、非损伤、多通道并行、高通量优势，是当前细胞功能研究首选检测手段。进口微孔荧光设备价格高昂、维护成本高、配套耗材兼容性受限，国内实验室亟需性能对标进口、自主可控的国产化荧光检测平台。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计专为细胞生物学、分子诊断实验优化，搭载自研宽光谱氙灯光源、双单色器分光系统、恒温微孔孵育模块、支持终点荧光、动力学时序荧光、激发 - 发射矩阵（EEM）全光谱扫描模式。
一、材料与仪器
（一）实验细胞与试剂
人肝癌 HepG2 细胞、HeLa 宫颈癌细胞、小鼠巨噬细胞 RAW264.7；DMEM 高糖培养基、胎牛血清 FBS、胰蛋白酶、无酚红 PBS 缓冲液；刃天青（Resazurin）细胞活性荧光试剂盒；Calcein-AM 活细胞探针、PI 死细胞核酸染料；顺铂阳性毒性药物；活性氧探针 DCFH-DA、线粒体膜电位探针 JC-1；无水乙醇（细胞固定用）。
（二）检测仪器
实验组：博清生物荧光计；
对照组：进口品牌荧光仪；
辅助设备：CO₂细胞培养箱、超净工作台、倒置荧光显微镜、高速离心机、细胞计数仪。
二、实验方法
（一）细胞培养与梯度铺板
三种细胞常规传代培养，消化后重悬于无酚红完全培养基，梯度稀释制备细胞悬液：1×10²、5×10²、1×10³、5×10³、1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶ cells/mL；每孔 200 μL 接种于孔透明细胞板，每组 6 复孔，37 ℃、5% CO₂培养 24 h，设置空白培养基对照孔。
（二）方案一：刃天青代谢荧光检测细胞总活细胞数
刃天青无荧光，仅活细胞完整线粒体还原生成强荧光试卤灵（Resorufin），荧光强度与细胞代谢活力正相关。每孔加入 20 μL 刃天青工作液，37 ℃避光孵育 2 h；博清荧光计设置激发波长 530 nm，发射波长 590 nm，恒温 37 ℃同步读取各孔荧光值；绘制细胞浓度 - 荧光强度标准曲线，计算线性相关系数、检出限、定量限。
（三）方案二：Calcein-AM/PI 双荧光区分活/死细胞
Calcein-AM 脂溶性穿透活细胞膜，胞内酯酶切割生成绿色荧光 Calcein（Ex 490 nm/Em 515 nm）；PI 无法穿透完整活细胞膜，仅染膜破损死细胞红色荧光（Ex 535 nm/Em 617 nm）。弃培养基，PBS 洗涤细胞，加入混合染色工作液避光室温孵育 15 min；博清荧光计开启双通道同步采集模式，一次读数同时获取活、死细胞荧光信号，计算细胞存活率：细胞存活率 = Calcein 荧光值/（Calcein 荧光值 + PI 荧光值）×100%
（四）药物细胞毒性动力学监测
HepG2 细胞铺板后，加入梯度浓度顺铂（0、2.5、5、10、20、40 μmol/L）处理 6、12、24 h；分别采用刃天青动力学荧光模式，博清荧光计每 30 min 自动采集荧光信号，实时记录细胞活性衰减曲线，计算半数抑制浓度 IC₅₀，对比进口仪器检测结果一致性。
（五）多参数同步联动检测
RAW264.7 巨噬细胞 LPS 诱导氧化应激，同步加入 Calcein-AM（细胞活性）、DCFH-DA（ROS，Ex 488/Em 525）、JC-1（线粒体膜电位，Ex 525/Em 590）；利用博清荧光计四通道并行扫描功能，单次检测同步获取细胞存活、氧化应激、线粒体功能三项指标，评估仪器多通道串扰误差。
（六）仪器性能评价指标
1）线性范围与线性相关系数 R²；2）检出限 LOD、定量限 LOQ；3）日内重复性；4）日间重复性（连续 3 天同批次细胞检测 RSD）；5）荧光通道交叉串扰值；6）恒温模块温度稳定性。
三、实验结果与分析
（一）细胞活性检测线性与灵敏度
以刃天青荧光法检测梯度细胞悬液，博清荧光计在 10²~10⁶ cells/mL 区间，荧光信号随细胞数量线性上升，HepG2、HeLa、RAW264.7 三种细胞标准曲线 R² 分别为 0.9992、0.9987、0.9989；仪器检出限低至 86 cells/mL，定量限 287 cells/mL。同条件进口对照设备 R²＞0.9985，检出限 92 cells/mL，二者线性性能无显著差异（P＞0.05）。
传统 CCK-8 比色法线性区间仅 5×10³~5×10⁵ cells/mL，低浓度细胞信号微弱、高浓度快速饱和，检出限达 10³ cells 级别，灵敏度显著低于荧光检测体系。
（二）仪器重复性与稳定性
博清荧光计日内重复 6 次读数，各细胞浓度荧光值 RSD 1.12%~2.76%；连续 3 天日间检测 RSD 1.58%~2.91%；孔板边缘孔与中心孔荧光偏差＜1.2%，自研光路消除微孔板边缘效应；内置恒温模块 37 ℃控温波动≤±0.3 ℃，孵育过程荧光信号漂移极小，适合长时间动力学细胞毒性监测。进口设备日内 RSD 1.05%~2.59%，两种仪器重复性指标处于同一水平。
（三）双荧光活死细胞区分效果
Calcein-AM/PI 双通道同步检测结果显示：未药物处理正常细胞 Calcein 荧光强、PI 荧光极低，细胞存活率 96.3%~98.7%；40 μmol/L 顺铂处理 24 h 损伤细胞 Calcein 信号显著下降，PI 红色荧光大幅升高，存活率仅 18.2%。博清荧光计双通道串扰仅 0.5%~0.7%，无红绿光谱相互干扰，可精准区分存活、凋亡、坏死细胞群体，数据与倒置荧光显微镜计数结果相关性 R²=0.9976。
（四）细胞毒性动态监测与 IC₅₀一致性
顺铂处理 HepG2 细胞时序动力学曲线显示，随药物浓度升高、处理时间延长，细胞代谢荧光信号持续下降；博清荧光计 24 h IC₅₀=11.36 μmol/L，进口设备 IC₅₀=11.08 μmol/L，两组数据无统计学差异（P＞0.05）。仪器动力学模式支持自定义采样间隔，无需终止实验、无需裂解细胞，实现同一孔细胞无损连续监测，可捕捉早期细胞轻微损伤，弥补终点法单一时间点数据局限。
（五）多参数同步检测性能
巨噬细胞氧化应激多指标同步检测中，博清荧光计四通道独立单色器分光，细胞活性、ROS、线粒体膜电位荧光信号互不干扰，通道间最大串扰 0.78%；单次孔板完整检测时长仅 120 s，大幅提升炎症、氧化损伤、细胞凋亡联合研究实验效率，单台仪器替代荧光计 + 活性氧检测仪多设备联用方案，降低实验室设备投入成本。
四、讨论
（一）博清荧光计硬件设计适配细胞活性检测核心需求
博清荧光计针对细胞生物学实验做专项硬件优化：①双光栅单色器实现 200~900 nm 连续波长可调，覆盖全部细胞活性、氧化应激、线粒体荧光探针光谱，无需更换滤光片，适配新型近红外活细胞探针；②低杂散光光路模块将本底荧光压低，大幅提升低细胞密度样本信噪比，适合干细胞、原代细胞等稀缺微量样本检测；③板载恒温 37 ℃孵育模块，荧光读取与细胞孵育同步完成，避免细胞取出后温度波动造成代谢信号偏差，是动力学活细胞监测关键硬件优势。
国产荧光设备长期存在光谱范围窄、通道串扰高、无恒温模块、线性区间窄等短板，本实验证实博清生物荧光计光学性能、定量精度、稳定性完全对标进口主流设备，打破进口仪器在细胞荧光定量领域垄断。
（二）两种荧光检测方案在细胞功能研究中的差异化应用场景
1、刃天青代谢荧光法：操作简便、单通道快速检测，侧重细胞整体代谢活力定量，适合大规模化合物细胞毒性初筛、生物材料相容性批量评价、细胞增殖曲线绘制；试剂温和、无细胞裂解，可完成多时间点动态追踪。
2、Calcein-AM/PI 双染荧光法：区分活细胞与膜破损死细胞，同步定量存活比例，适用于细胞凋亡、冷冻复苏细胞活力、免疫细胞杀伤功能、缺氧细胞损伤机制等精细细胞功能研究；双通道同步采集大幅减少实验操作步骤，降低样本损耗。
两种方案均可在博清荧光计上一键切换检测程序，无需调整硬件，一套仪器覆盖绝大多数细胞活性相关实验。
（三）荧光检测相较于传统细胞活性方法的综合优势
对比 MTT、CCK-8 可见光比色法：荧光法灵敏度提升 10 倍以上，无高浓度信号饱和问题，可同时获取多生理参数，非损伤监测活细胞动态变化；
对比 ATP 发光法：无需细胞裂解，可重复检测同一细胞样本，发光试剂稳定性差、易受培养基离子干扰，荧光探针抗干扰能力更强；
对比流式细胞术：微孔板高通量、样本用量少、操作流程简化，无需制备单细胞悬液，贴壁细胞可直接原位检测，降低细胞解离造成的额外损伤误差。
（四）国产化荧光平台对细胞功能研究的应用价值
当前国内生物医药、细胞治疗、干细胞基础研究实验室大量依赖进口荧光酶标仪，设备采购、年度维护、专用滤光片耗材成本高昂，供货周期长。博清生物全自主研发荧光计整机、光路系统、配套分析软件，设备售价、运维成本显著低于进口产品，软件内置标准化细胞活性、细胞毒性、ROS 检测分析模板，自动输出标准曲线、IC₅₀、细胞存活率报告，降低实验人员数据分析门槛。同时仪器开放数据导出接口，兼容第三方生物信息学分析软件，满足高水平科研论文数据产出要求。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计为细胞活性定量检测提供稳定、可靠、低成本的国产化检测平台，在细胞生物学、药理学、再生医学等领域具备广阔推广应用前景。后续可基于该仪器开发三维类器官、共培养细胞模型荧光定量检测方案，进一步拓展复杂细胞功能体系研究应用。
