细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡，由内源线粒体通路与外源死亡受体通路协同调控，贯穿胚胎发育、免疫清除、肿瘤细胞清除、氧化应激损伤、药物毒理等全部细胞功能研究场景。凋亡过程存在时序性特征：早期线粒体膜电位 ΔΨm 下降、活性氧爆发；中期执行蛋白 Caspase-3 活化切割下游底物；晚期细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻、DNA 片段化、细胞膜破损坏死。单一指标检测易造成凋亡阶段误判，多参数同步定量是当前细胞功能研究的主流技术趋势。
目前实验室主流凋亡定量方法包含流式细胞术、荧光显微镜、普通单通道荧光酶标仪三类：流式细胞仪通量有限、样本制备复杂、设备维护成本高；荧光显微镜仅能定性观察、难以批量定量；常规荧光读板仪通道单一，无法同步完成 JC-1 双荧光比值、Caspase 紫外荧光、Annexin V 双色分型同步检测，多指标实验需分板重复，引入操作误差。
博清生物科技（南京）有限公司自主研发荧光计，搭载连续可调激发/发射单色器、同步荧光采集、内置微孔板温控模块与自动化数据拟合算法，覆盖紫外、可见光全波段荧光检测需求，兼容活细胞原位荧光与细胞裂解液酶活定量双重实验体系。
一、材料与仪器
（一）实验细胞与试剂
人宫颈癌细胞 HeLa，本实验室液氮冻存；DMEM 高糖完全培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS 缓冲液（Gibco）；凋亡诱导剂星形孢菌素 Staurosporine（STS，1 mM 母液）；JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡双染试剂盒、Caspase-3 活性检测试剂盒（含底物 Ac-DEVD-AMC）；Caspase-3 特异性抑制剂 Z-DEVD-FMK；细胞裂解液、蛋白酶抑制剂混合液；96 孔细胞培养板、黑色透光微孔荧光板。
（二）检测仪器
实验组：博清生物荧光计；对照仪器：商用高端流式细胞仪、单通道荧光酶标仪；辅助设备：CO₂细胞培养箱、高速冷冻离心机、超净工作台、倒置生物显微镜。
二、实验方法
（一）细胞培养与凋亡模型构建
HeLa 细胞接种于 96 孔黑色荧光培养板，每孔细胞密度 5×10³ 个，37℃、5% CO₂培养至细胞贴壁汇合度 70%；设置空白对照组（培养基处理）、阴性对照组（DMSO 溶剂）、凋亡诱导组（梯度 STS 浓度：0.1、0.5、1、2、5 μM，处理 12 h）、抑制剂对照组（5 μM STS + 20 μM Z-DEVD-FMK 共处理）；每组 6 复孔。
（二）多指标荧光检测方案（博清荧光计一体化检测）
1、凋亡早期：JC-1 线粒体膜电位 ΔΨm 检测
弃培养基，PBS 洗涤细胞 2 次，每孔加入 JC-1 工作液 100 μL，37℃避光孵育 20 min；洗涤后加入检测缓冲液，使用博清荧光计双通道同步读数：
JC-1 聚合体红色荧光：Ex 540 nm，Em 590 nm；
JC-1 单体绿色荧光：Ex 485 nm，Em 535 nm；
仪器自动计算红/绿荧光强度比值，比值降低代表线粒体膜电位下降，凋亡早期损伤加重。
2、凋亡中期：Caspase-3 蛋白酶活性定量
收集同批次平行孔细胞，预冷裂解液冰上裂解 20 min，12 000 rpm 4℃离心 10 min 取上清蛋白；上清与 DEVD-AMC 底物缓冲液混合，37℃避光酶促反应 60 min；博清荧光计紫外通道检测：Ex 380 nm，Em 460 nm；荧光强度与活化 Caspase-3 含量正相关，反映凋亡执行通路激活水平。设置底物空白、裂解液空白扣除背景荧光。
3、凋亡晚期：Annexin V-FITC/PI 双色分型
消化收集细胞，PBS 洗涤重悬于结合缓冲液，加入 FITC-Annexin V 与 PI 避光孵育 15 min；转移至黑色微孔板，博清荧光计双通道同步采集：
FITC 绿色荧光（早期凋亡）：Ex 488 nm，Em 525 nm；
PI 红色荧光（坏死/晚期凋亡）：Ex 535 nm，Em 617 nm；
通过双荧光强度分区定量活细胞、早期凋亡、晚期凋亡、坏死细胞占比。
（三）仪器性能验证实验
线性范围：梯度凋亡细胞裂解液稀释系列检测 Caspase-3 荧光强度，拟合标准曲线，计算决定系数 R²；
重复性实验：同一阳性样本连续 6 次读数计算批内 CV；同批次 6 块微孔板平行检测计算批间 CV；
方法比对：相同 STS 诱导样本分别采用博清荧光计与流式细胞仪检测凋亡率，线性回归分析相关性；
信噪比：空白缓冲液与最高荧光样本信号差值计算信噪比。
三、实验结果
（一）STS 诱导细胞凋亡浓度梯度效应（多指标同步定量）
随 STS 诱导浓度升高，博清荧光计检测结果呈现规律变化：
1、JC-1 红/绿比值呈浓度依赖性下降：5 μM STS 组比值较对照组下降 68.3%（P＜0.001），线粒体膜电位显著崩溃，凋亡早期损伤加剧；
2、Caspase-3 荧光强度显著上升：5 μM STS 组荧光信号为对照组 7.2 倍，加入 Caspase 抑制剂后荧光强度回落至接近基线水平，证明信号特异性依赖 Caspase 活化；
3、Annexin V 阳性荧光强度同步升高，晚期凋亡 PI 阳性细胞比例随药物浓度递增，三重指标变化趋势完全吻合，实现凋亡全程时序同步定量。
（二）博清生物荧光计仪器性能评价
1、线性关系：Caspase-3 活性标准曲线 R²=0.9992，在蛋白浓度 0.05–2 μg 区间线性良好，宽动态范围适配高低凋亡水平样本；
2、重复性：批内变异系数 CV=2.14%，批间 CV=3.28%，检测稳定性显著优于普通单通道荧光酶标仪（CV＞7%）；
3、方法比对：荧光计定量凋亡率与流式细胞术检测结果线性相关 r=0.992，两种方法定量结果无显著统计学差异（P＞0.05）；
4、信噪比：整机信噪比 1120:1，低凋亡本底信号干扰极低，可精准识别微量早期凋亡细胞。
（三）高通量适配性对比优势
传统检测流程需分 3 块微孔板分别检测 JC-1、Caspase、Annexin V 指标，操作时长＞3 h；采用博清生物荧光计，可完成三重荧光同步采集，全程操作缩短至 90 min，试剂消耗量降低 60%，无分板操作带来的系统误差；内置 37℃温控模块可实现活细胞原位实时动态监测凋亡随时间变化，适用于抗肿瘤药物高通量细胞凋亡筛选模型。
四、讨论
细胞凋亡多阶段多通路的分子特征决定了单指标检测存在局限性：仅检测 Caspase 活性无法区分凋亡启动早期线粒体损伤；仅 JC-1 膜电位检测不能区分凋亡与氧化应激损伤；Annexin V 双染仅能表征晚期膜外翻状态。本研究依托博清生物多功能荧光计的多通道同步检测能力，建立线粒体损伤 - 蛋白酶活化 - 细胞膜外翻三位一体凋亡定量体系，完整覆盖凋亡早、中、晚期关键分子事件，解决传统仪器只能单指标分次检测的技术短板。
从仪器硬件层面分析，博清生物荧光计采用连续单色器光路，区别于固定滤光片式普通酶标仪，可精准匹配 JC-1、DEVD-AMC、FITC、PI荧光探针专属激发/发射波长，避免光谱串色干扰；自动荧光比值运算模块直接输出 JC-1 红/绿比值，省去人工换算步骤，降低人为计算误差；微孔板恒温模块支持活细胞实时动力学检测，可追踪凋亡诱导 0–24 h 动态变化曲线，拓展细胞功能动态研究场景。
与流式细胞仪相比，博清生物荧光计无需消化制备单细胞悬液，可直接原位检测贴壁细胞，减少机械消化造成的细胞损伤与 PS 假阳性外翻，实验操作门槛更低、样本损耗更小、单次检测样本数量提升 4–8 倍，更适合大规模药物筛选、氧化应激损伤、干细胞毒性批量评价等研究场景。本研究验证其定量准确度与流式高度一致，完全可替代流式完成常规凋亡定量检测；针对微量珍贵原代细胞、类器官模型，低样本消耗优势更为突出。
本研究以博清生物荧光计为核心平台，成功建立同步检测线粒体膜电位、Caspase-3 活性、磷脂酰丝氨酸外翻的细胞凋亡多参数一体化定量检测方案。该国产荧光设备具备宽光谱检测、多通道同步读数、高信噪比、优异重复性与高通量优势，检测线性范围广，定量结果与流式细胞术高度吻合；单板多指标同步检测大幅简化实验流程、降低试剂与时间成本，可完整表征细胞凋亡全阶段分子特征。
博清生物荧光计突破进口荧光检测设备价格壁垒，为细胞凋亡、细胞活力、氧化应激、药物毒性等细胞功能基础研究提供国产化标准化检测工具，在肿瘤药理、再生医学、毒理学高通量筛选领域具备广泛推广与应用价值。
