酶作为生物体内高效、专一的生物催化剂，其活性异常与肿瘤、神经退行性疾病、代谢紊乱等重大疾病密切相关。酶抑制剂与激活剂通过调控靶酶活性，成为疾病治疗药物（如阿司匹林、他汀类药物）、生物农药及工业生物催化剂优化的核心研究对象。因此，建立高灵敏度、快速、低成本、微量样品适配的酶活性检测及调控分子筛选技术，具有重要科研与应用价值。
荧光法凭借灵敏度高（较分光光度法高 1–2 个数量级）、特异性强、背景干扰低等优势，成为酶活性检测的主流技术。传统大型荧光分光光度计虽性能全面，但存在设备昂贵、体积庞大、操作复杂、依赖专业实验室等问题，难以满足现场快速检测、基层科研及高通量初筛需求。博清生物科技（南京）有限公司研发的YQG-01X是一款便携式双通道荧光计，兼具便携性、高灵敏度、低成本等特点，适配 Qubit® 系列荧光试剂，可实现微量样品（1–20 μL）快速定量检测。
一、材料与方法
（一）仪器与试剂
1、仪器：博清生物 YQG-01X 便携式荧光计；高速冷冻离心机；恒温水浴锅；96 孔黑色微孔板。
2、试剂：胰蛋白酶；荧光素标记肽底物；苯甲脒；氯化镁；Tris-HCl 缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.0，含 0.15 mol/L NaCl）；超纯水。
（二）实验体系构建
1、试剂配制
酶储备液：准确称取胰蛋白酶，用 Tris-HCl 缓冲液溶解，配制成 1 mg/mL 储备液，-20 ℃分装避光保存，实验前稀释至所需浓度。
底物储备液：将荧光底物用 DMSO 溶解，配制成 1 mmol/L 储备液，-20 ℃避光保存，实验前用缓冲液稀释至工作浓度（10–100 μmol/L）。
抑制剂/激活剂溶液：苯甲脒、MgCl₂分别用缓冲液配制成 10 mmol/L 储备液，梯度稀释至 0.1–100 μmol/L 工作液。
2、酶活性检测原理
荧光底物 Boc-Gln-Arg-Arg-AMC 本身无荧光，在胰蛋白酶催化下水解，释放出7 - 氨基 - 4 - 甲基香豆素（AMC），该产物在激发波长 470 nm、发射波长 520 nm 处产生强荧光。荧光强度与酶活性在一定范围内呈线性正相关，通过检测荧光强度变化可定量酶活性。
3、标准检测流程
总反应体系 20 μL，各组分配比：Tris-HCl 缓冲液 14 μL、酶液 2 μL、底物工作液 4 μL（终浓度 20 μmol/L）。体系混匀后，37 ℃避光孵育 15 min，立即置于 YQG-01X 荧光计中检测荧光强度（激发 470 nm，发射 520 nm）。空白组以缓冲液替代酶液，对照组不加抑制剂/激活剂，每组 3 次重复。
（三）方法学验证
1、线性关系：设置胰蛋白酶浓度梯度（0.1–10 μg/mL），按标准流程检测，以荧光强度对酶浓度绘制标准曲线，计算线性回归方程与相关系数（R2）。
2、灵敏度：以空白组荧光强度均值 + 3 倍标准差为检出限（LOD），均值 + 10 倍标准差为定量限（LOQ），评估设备检测灵敏度。
3、精密度：配制低、中、高 3 种浓度酶液（0.5、2、8 μg/mL），同日内重复检测 6 次（日内精密度），连续 3 天检测（日间精密度），计算相对标准偏差（RSD）。
4、稳定性：酶反应体系孵育后，分别在 0、5、10、15、30 min 检测荧光强度，评估信号稳定性。
（四）酶动力学参数测定
设置底物浓度梯度（5–80 μmol/L），固定酶浓度（2 μg/mL），按标准流程检测反应速率（荧光强度/时间）。采用米氏方程v=Vmax×[S]/(Km+[S])，通过 GraphPad Prism 9 软件非线性回归拟合，计算Km与Vmax。
（五）抑制剂与激活剂筛选验证
1、抑制剂实验：在反应体系中加入不同浓度苯甲脒（0.1–50 μmol/L），固定酶与底物浓度，检测荧光强度，计算抑制率（抑制率 =（对照组荧光强度 - 实验组荧光强度）/对照组荧光强度 ×100%），通过非线性回归计算半抑制浓度（IC50）与抑制常数（Ki）。
2、激活剂实验：加入不同浓度 MgCl₂（0.5–20 mmol/L），检测荧光强度，计算激活率（激活率 =（实验组荧光强度 - 对照组荧光强度）/对照组荧光强度 ×100%），评估激活效果。
二、结果与分析
（一）方法学验证结果
1、线性关系
在0.1–10 μg/mL范围内，胰蛋白酶浓度与荧光强度呈良好线性关系，回归方程为(y=125.6x+28.3)，(R2=0.998)，表明该体系可精准定量酶活性。
2、灵敏度
空白组荧光强度为(32.5±4.2)，计算得 LOD 为 0.12 μg/mL，LOQ 为 0.4 μg/mL，检出限达pg 级，远低于传统分光光度法（LOD≈1 μg/mL），适配低浓度酶样品检测。
3、精密度
日内精密度 RSD 为 1.2%–2.5%，日间精密度 RSD 为 2.1%–3.8%，均小于5%，表明设备检测精密度优异，数据可靠。
4、稳定性
反应后 30 min 内，荧光强度无显著波动（RSD=2.8%），表明 AMC 产物荧光稳定性良好，可满足批量样品检测需求。
（二）抑制剂筛选效果
苯甲脒对胰蛋白酶呈浓度依赖性抑制，IC50=5.2±0.4μmol/L，Ki=2.1±0.3μmol/L，与文献报道的特异性抑制效果一致。低浓度（0.1 μmol/L）抑制率仅 8.5%，高浓度（50 μmol/L）抑制率达 92.3%，表明该体系可有效区分抑制剂活性差异，适用于抑制剂初筛与活性定量。
（三）激活剂筛选效果
Mg²⁺对胰蛋白酶呈低浓度激活、高浓度抑制的双相效应：0.5–5 mmol/L 范围内，激活率随浓度升高而增加，5 mmol/L 时激活率达峰值（42.5%）；浓度超过 5 mmol/L 后，激活率逐渐下降，20 mmol/L 时转为轻度抑制（抑制率 12.3%）。该结果符合金属离子对丝氨酸蛋白酶的调控规律，验证了体系在激活剂筛选中的有效性。
（四）设备性能对比
与传统大型荧光分光光度计及同类便携式设备相比，YQG-01X荧光计在酶学分析中优势显著：体积小、重量轻、无需专业实验室，适配现场检测；样品量仅 1–20 μL，大幅降低试剂消耗；5 秒/样本快速检测，适配高通量初筛；双通道设计，可同步检测两种荧光探针，适配多酶体系或多参数检测。
三、讨论
本研究首次系统验证了博清生物科技（南京）有限公司研发的 YQG-01X 便携式荧光计在酶活性定量、动力学参数测定、抑制剂/激活剂筛选中的应用价值。该设备凭借高灵敏度、微量样品适配、快速检测、便携低成本等核心优势，突破了传统大型荧光设备的应用限制，为酶学研究提供了灵活高效的技术方案。
方法学验证结果显示，该检测体系线性范围宽、灵敏度高、精密度与稳定性优异，可精准定量低浓度酶活性，适配微量样品检测（如细胞裂解液、组织匀浆等生物样本）。动力学参数测定结果与文献一致，表明设备可准确反映酶催化特性，适用于酶作用机制、底物特异性等基础研究。抑制剂与激活剂实验中，体系可有效识别调控分子的活性差异，定量IC50、Ki及激活率，满足高通量初筛、活性排序、机制验证等药物研发需求。
相较于传统设备，YQG-01X 荧光计的便携性与低成本是核心竞争力。其无需专业实验室与复杂维护，可实现现场快速检测、基层科研普及、野外样本分析；微量样品设计大幅降低试剂消耗，尤其适用于昂贵试剂或稀缺样本检测；双通道设计可拓展至多酶共检测、底物与产物同步监测等场景，提升实验效率。
本研究以胰蛋白酶为模式酶，验证了体系的通用性。后续可拓展至蛋白酶、激酶、酯酶等多种酶类，适配不同荧光探针（如 AMC、FITC、罗丹明等），构建多元化酶活性检测与调控分子筛选平台。此外，结合 96 孔板适配器，可进一步提升检测通量，满足大规模化合物库筛选需求。
博清生物科技（南京）有限公司研发的 YQG-01X 便携式荧光计可作为酶活性分析及抑制剂/激活剂筛选的可靠工具，构建的荧光检测体系具有灵敏度高、快速便捷、微量适配、成本低廉等优势，可精准定量酶活性、测定动力学参数、评估调控分子活性。该设备突破了传统大型荧光设备的应用局限，为基础酶学研究、靶向酶药物研发、基层科研普及提供了高效可行的技术方案，具有广阔的科研与应用前景。
