遗传病是由遗传物质异常引发的疾病，包括单基因病、染色体病及多基因病，其中基因拷贝数变异（CNV）作为基因组结构变异的重要类型，指基因组片段的缺失、重复（长度 1kb~5Mb），可导致基因剂量异常，是脊髓性肌萎缩症、杜氏肌营养不良症、1p36 微缺失综合征等数百种遗传病的核心致病因素。传统 CNV 检测技术如 MLPA、array-CGH，虽准确性高，但存在操作繁琐、检测周期长、成本高昂等缺陷，难以满足快速筛查与基层普及需求。
实时荧光定量 PCR（qPCR）凭借实时监测、精准定量、操作简便、成本低廉等优势，已成为 CNV 检测的主流技术之一。其原理是通过荧光信号实时追踪 PCR 扩增过程，基于循环阈值（Ct 值）与起始模板拷贝数的线性关系，实现基因拷贝数的定量分析。博清生物科技（南京）有限公司自主研发的 BOD-16PE 荧光定量 PCR 仪，搭载高精度温控系统、4 色荧光检测通道及便携化设计，适配科研场景的 CNV 检测需求。
一、材料与方法
（一）仪器与试剂
1、检测仪器：博清生物 BOD-16PE 荧光定量 PCR 仪；对照仪器：某品牌qPCR仪、SALSA MLPA P021试剂盒配套仪器。
2、试剂：SMN1 基因（外显子7）TaqMan拷贝数检测试剂盒（FAM 标记）、内参基因 RNase P 试剂盒（VIC 标记）；1p36 区域特异性探针试剂盒（FAM 标记）、内参基因 GAPDH 试剂盒（VIC 标记）；基因组 DNA 提取试剂盒（磁珠法）。
（二）实验方法
1、基因组 DNA 提取
取外周血 2mL，EDTA 抗凝，严格按照 DNA 提取试剂盒说明书操作，提取基因组 DNA，采用紫外分光光度计检测 DNA 浓度（50~100ng/μL）及纯度（OD260/OD280=1.8~2.0），合格 DNA 置于 - 20℃保存备用。
2、qPCR 反应体系配制
采用双重荧光标记法（目的基因 + 内参基因），20μL 反应体系：TaqMan 预混液 10μL、目的基因探针（10μmol/L）1μL、内参基因探针（10μmol/L）1μL、模板 DNA 2μL、无酶水 6μL。充分混匀后，离心 30s，置于 BOD-16PE 仪器反应模块。
3、qPCR 扩增程序设置
扩增程序：95℃预变性 3min；95℃变性 15s，60℃退火/延伸 45s，40 个循环；荧光信号在 60℃阶段收集（FAM：510nm，VIC：550nm）。仪器自动采集荧光信号，生成扩增曲线，计算 Ct 值。
4、性能验证
灵敏度与特异性：以 MLPA/array-CGH 结果为金标准，计算 BOD-16PE 检测的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值。
准确性：分析 BOD-16PE 与金标准结果的一致性（Kappa 检验）。
重复性：选取 3 份不同拷贝数样本（0、2、3 拷贝），每份样本重复检测 10 次，计算 Ct 值变异系数（CV），评估仪器重复性。
稳定性：将样本分别置于 - 20℃保存 1 个月、室温保存 7 天，检测拷贝数，评估仪器对不同保存条件样本的稳定性。
二、结果
（一）扩增曲线与熔解曲线分析
BOD-16PE 仪器可清晰采集 FAM（目的基因）与 VIC（内参基因）荧光信号，扩增曲线呈典型 S 型，基线平稳、指数期明显、平台期清晰，无杂峰、非特异性扩增及引物二聚体干扰；熔解曲线单一锐利，Tm 值稳定，提示扩增特异性良好，可精准区分目的基因与内参基因扩增产物。
（二）灵敏度、特异性与准确性分析
以 MLPA/array-CGH 结果为金标准，BOD-16PE 检测 220 例样本，结果如下：
1、SMA 样本：120 例样本中，检出 0 拷贝 34 例、1 拷贝 46 例、2 拷贝 40 例，与金标准一致性 119/120（99.2%）；
2、1p36 样本：60 例样本中，检出缺失 21 例、正常 39 例，与金标准一致性 59/60（98.3%）；
3、健康对照：40 例样本均检出 2 拷贝，无假阳性。
整体性能：灵敏度 99.2%（124/125）、特异性 99.5%（94/95）、阳性预测值 99.2%、阴性预测值 99.5%；Kappa=0.983（P＜0.001），提示 BOD-16PE 与金标准结果高度一致，准确性优异。
（三）重复性与稳定性分析
1、重复性：0、2、3 拷贝样本重复检测 10 次，目的基因 Ct 值分别为 28.56±0.21、25.12±0.15、22.34±0.12，CV 值分别为 0.73%、0.60%、0.54%，均＜2%，提示仪器重复性极佳。
2、稳定性：-20℃保存 1 个月、室温保存 7 天的样本，拷贝数检测结果与新鲜样本一致，Ct 值波动＜0.3，提示仪器对不同保存条件样本稳定性良好，适配样本批量检测需求。
（四）仪器性能优势分析
BOD-16PE 在 CNV 检测中展现显著优势：
1、精准温控：半导体制冷技术，控温精度 ±0.1℃、均匀性 ±0.15℃，确保 PCR 扩增效率一致，减少 Ct 值误差，适配 CNV 精准定量；
2、多通道兼容：4 色荧光通道，支持双重/多重探针检测，可同时检测目的基因与内参基因，降低实验误差，提高检测效率；
3、高效便捷：16 孔反应模块，兼容 8 联排管，单次可检测 16 份样本，检测周期约 1.5h；7 寸触摸屏操作，无需连接电脑，内置数据分析软件，自动生成报告，适配基层实验室快速检测；
三、讨论
基因拷贝数变异是遗传病的重要致病机制，精准、快速、经济的 CNV 检测技术是遗传病诊断与筛查的关键。本研究证实，博清生物 BOD-16PE 荧光定量 PCR 仪在 SMA、1p36 微缺失综合征等遗传病 CNV 检测中，具备高灵敏度、高特异性、高准确性及优异重复性，与 MLPA/array-CGH 金标准结果高度一致，可满足科研需求。
SMA 是常见的常染色体隐性遗传病，发病率约 1/6000~1/10000，由 SMN1 基因缺失或突变导致，95% 以上 SMA 患者为 SMN1 基因纯合缺失（0 拷贝），携带者为杂合缺失（1 拷贝）。快速准确检测 SMN1 基因拷贝数，对 SMA 患者确诊、携带者筛查及产前诊断至关重要。本研究中，BOD-16PE 检测 SMA 样本的一致性达 99.2%，可精准区分 0、1、2 拷贝，适配 SMA 大规模携带者筛查场景。
1p36 微缺失综合征是最常见的染色体末端微缺失综合征，发病率约 1/5000，表现为发育迟缓、智力障碍、面部畸形等，由 1p36.33-p36.32 区域缺失导致。本研究中，BOD-16PE 可准确检出该区域缺失，与 array-CGH 结果一致性达 98.3%，为该病快速筛查提供高效手段。
与传统 CNV 检测技术相比，BOD-16PE 搭载的 qPCR 技术优势显著：操作简便（无需复杂样本处理）、检测快速（1.5h 出结果）、成本低廉（单样本检测成本约为 MLPA 的 1/5）、通量灵活（16 孔适配中小型实验室）。同时，仪器便携化设计（重量轻、无需外接电脑），可满足基层医院、妇幼保健院等机构现场检测需求，助力遗传病筛查下沉。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量 PCR 仪凭借精准温控、多通道荧光检测、高效便捷、高灵敏度等优势，在遗传病基因拷贝数变异检测中表现优异，可精准区分 0~5 拷贝基因缺失/重复，与金标准结果高度一致，重复性、稳定性良好。该仪器适配遗传病筛查、携带者检测及科研研究需求，尤其适合基层实验室推广应用，为遗传病精准诊断提供可靠、经济、高效的技术支撑，具有重要的应用价值与广阔的市场前景。
