荧光检测技术凭借灵敏度高、特异性强、样品用量少、无放射性污染等优势，已逐渐替代传统方法成为分子生物学检测的主流技术。博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计作为一款紧凑型检测设备，专为微量核酸和蛋白质浓度的定量检测设计，可实现1~20μL样品的快速精准测定，同时支持荧光探针法的实时信号监测，具备操作便捷、检测快速、稳定性好等特点，理论上可满足核酸与蛋白定量及核酸酶活性检测的多重需求。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器 博清生物荧光计；紫外分光光度计；高速冷冻离心机；恒温水浴锅；超纯水机。
2、试剂与样品 dsDNA标准品（λ噬菌体，浓度100ng/μL）、ssDNA标准品（鲑鱼精DNA，浓度50ng/μL）、RNA标准品（酵母总RNA，浓度80ng/μL）、牛血清白蛋白（BSA，浓度10μg/μL）；DNaseⅠ（100U/mL）、RNase A（100U/mL）；核酸定量荧光染料（dsDNA、ssDNA、RNA专用）、蛋白质定量荧光染料（BR专用）、DNaseⅠ活性检测荧光探针（535/565nm）、RNase A活性检测荧光探针（490/520nm）；Tris-HCl缓冲液（10mmol/L，pH 7.5）、EDTA溶液（1mmol/L）均为国产分析纯，实验用水为超纯水（电阻率≥18.2MΩ·cm）。
（二）实验方法
1、博清生物荧光计参数设置
根据不同检测目的设置仪器参数：核酸定量（dsDNA、ssDNA、RNA）分别选用对应专用荧光染料，激发/发射波长分别为490/520nm（dsDNA）、480/510nm（ssDNA）、500/530nm（RNA）；蛋白质定量选用BR专用荧光染料，激发/发射波长为480/590nm；核酸酶活性检测中，DNaseⅠ选用535/565nm波长组合，RNase A选用490/520nm波长组合，检测模式为实时动力学检测，扫描间隔1min，总检测时间30min，反应温度37℃（模拟生理条件），狭缝宽度5nm，增益值调至最佳（避免信号饱和）。
2、核酸定量实验
分别配制系列浓度的dsDNA（0.2、1、5、10、20、50、100ng/μL）、ssDNA（0.1、0.5、2、5、10、25、50ng/μL）、RNA（0.2、1、4、10、20、40、80ng/μL）标准品。按照荧光染料说明书，取1μL标准品与9μL荧光染料混合，室温孵育5min后，加入博清生物荧光计检测杯，每个浓度设置3个平行重复，测定荧光强度。以标准品浓度为横坐标（x），荧光强度为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算相关系数（R²）、检测限（LOD，以3倍空白荧光强度标准差对应的浓度计算）及精密度（RSD，n=3）。
同时，采用紫外分光光度法对上述系列浓度标准品进行检测，每个浓度设置3个平行重复，测定260nm（核酸）处的吸光度，绘制标准曲线，计算相关系数、检测限及精密度，与博清生物荧光计检测结果进行对比。
3、蛋白质定量实验
配制系列浓度的BSA标准品（0.1、0.5、1、2、5、8、10μg/μL），按照蛋白质定量荧光染料说明书，取2μL标准品与8 μL荧光染料混合，室温孵育10min后，加入博清生物荧光计检测杯，每个浓度设置3个平行重复，测定荧光强度。以BSA浓度为横坐标（x），荧光强度为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算R²、检测限及精密度。
采用紫外分光光度法测定上述BSA标准品在280nm处的吸光度，绘制标准曲线，计算相关参数，与博清生物荧光计检测结果对比。
4、核酸酶活性检测实验
1）核酸酶标准曲线建立 分别配制系列浓度的DNaseⅠ（0.01、0.1、0.5、1、2、5、10U/mL）、RNase A（0.01、0.1、0.5、1、2、5、10U/mL）标准品。按照荧光探针说明书，配制反应体系（总体积20μL）：10μL荧光探针溶液、5μL核酸酶标准品、5μL Tris-HCl缓冲液（10mmol/L，pH7.5），混匀后加入博清生物荧光计检测杯，37℃孵育，实时监测荧光强度变化，每个浓度设置3个平行重复。以核酸酶浓度为横坐标（x），30min时的荧光强度差值（ΔF，即最终荧光强度与初始荧光强度的差值）为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算R²、检测限及精密度。
2）样品检测 选取3组不同活性水平的DNaseⅠ、RNase A样品（未知浓度），按照上述反应体系与检测方法，采用博清生物荧光计测定其荧光强度变化，根据标准曲线计算样品中核酸酶的活性，每个样品设置3个平行重复，计算测定值的RSD，验证方法的重复性。同时，采用凝胶电泳法对样品进行检测，对比两种方法的检测结果。
5、抗干扰实验
选取核酸定量中常见干扰物质（NaCl、EDTA、甘油）及蛋白质定量中常见干扰物质（Tris-HCl、SDS、蔗糖），分别设置不同浓度梯度（干扰物质浓度为0.1、1、10mmol/L），加入到已知浓度的核酸（dsDNA，10ng/μL）、蛋白质（BSA，1μg/μL）标准品中，采用博清生物荧光计测定其浓度，计算测定值与真实值的偏差（偏差≤5%为无明显干扰），验证仪器的抗干扰能力。
二、结果与分析
（一）博清生物荧光计在核酸定量中的性能验证
1、标准曲线与线性范围 博清生物荧光计检测dsDNA、ssDNA、RNA的标准曲线均呈现良好的线性关系，dsDNA的线性方程为y=12.35x+4.28，R²=0.999；ssDNA的线性方程为y=10.82x+3.95，R²=0.998；RNA的线性方程为y=11.56x+4.12，R²=0.999，线性范围分别覆盖0.2~100ng/μL、0.1~50ng/μL、0.2~80ng/μL，均满足常规科研中核酸定量的需求。
2、检测限与精密度 博清生物荧光计检测dsDNA、ssDNA、RNA的检测限分别为0.04ng/μL、0.03ng/μL、0.05ng/μL，精密度RSD分别为1.8%、2.1%、2.3%，表明该仪器检测核酸的灵敏度高、重复性好。
3、与紫外分光光度法的对比 紫外分光光度法检测dsDNA、ssDNA、RNA的线性范围较窄（分别为5~50ng/μL、2~25ng/μL、5~40ng/μL），R²均≤0.990，检测限为0.5~1.0ng/μL，精密度RSD为3.5%~5.2%。与紫外分光光度法相比，博清生物荧光计的线性范围更宽、检测限更低、精密度更高，且对低浓度核酸样品的检测效果更优，这是由于荧光染料对核酸具有特异性结合能力，可有效避免游离核苷酸、蛋白质等杂质的干扰，而紫外分光光度法无法区分核酸与其他紫外吸收物质，易产生假阳性结果。
（二）博清生物荧光计在蛋白质定量中的性能验证
1、标准曲线与线性范围 博清生物荧光计检测BSA的标准曲线线性关系良好，线性方程为y=8.62x+3.57，R²=0.999，线性范围为0.1~10μg/μL，覆盖常规科研中蛋白质定量的浓度范围。
2、检测限与精密度 博清生物荧光计检测BSA的检测限为0.03μg/μL，精密度RSD为1.7%，表明该仪器检测蛋白质的灵敏度与重复性均优于紫外分光光度法（紫外分光光度法检测限为0.2μg/μL，RSD为4.3%）。
3、抗干扰能力 抗干扰实验结果显示，当NaCl、EDTA、甘油等干扰物质浓度≤10mmol/L时，博清生物荧光计检测核酸浓度的偏差≤4.2%；当Tris-HCl、SDS、蔗糖等干扰物质浓度≤10 mmol/L时，检测蛋白质浓度的偏差≤3.8%（表2），表明该仪器具有较强的抗干扰能力，可适用于复杂样品的检测。
（三）博清生物荧光计在核酸酶活性检测中的性能验证
1、核酸酶标准曲线与线性范围 博清生物荧光计检测DNaseⅠ、RNase A的标准曲线均呈现良好的线性关系，DNaseⅠ的线性方程为y=15.62x+5.31，R²=0.998；RNase A的线性方程为y=14.85x+4.98，R²=0.995，线性范围均为0.01~10U/mL，可满足不同活性水平核酸酶的检测需求。
2、检测限与精密度 博清生物荧光计检测DNaseⅠ、RNase A的检测限分别为0.005U/mL、0.006U/mL，精密度RSD分别为1.9%、2.2%，表明该仪器可灵敏检测低活性核酸酶，且重复性良好。
3、样品检测结果3组未知活性的DNaseⅠ、RNase A样品经博清生物荧光计检测，测定值的RSD均≤2.5%，表明方法的重复性良好；与凝胶电泳法检测结果相比，两种方法的测定值无显著差异（P>0.05），但博清生物荧光计可实现核酸酶活性的定量检测，且操作更快速、无需凝胶制备与染色，检测效率显著高于凝胶电泳法。此外，实时动力学曲线显示，核酸酶活性越高，荧光信号增长速率越快，30min时的荧光强度差值越大，可直观反映核酸酶的活性水平，这与荧光探针法的检测原理一致——当样品中存在核酸酶时，荧光探针被降解，荧光基团与淬灭基团分离，荧光信号随酶活性增强而升高，且信号增长速率与酶活性呈正相关。
三、讨论
核酸与蛋白定量、核酸酶活性检测是分子生物学研究的基础实验，其检测方法的性能直接影响后续实验的可靠性与准确性。传统紫外分光光度法因灵敏度低、抗干扰能力弱，难以满足低浓度样品的检测需求；凝胶电泳法、放射性标记法在核酸酶活性检测中存在操作繁琐、耗时、有污染风险等问题，限制了其广泛应用。荧光检测技术基于特异性荧光染料或探针与目标分子的结合，具有灵敏度高、特异性强、样品用量少等优势，已成为分子生物学检测的首选技术。
博清生物荧光计作为一款紧凑型荧光检测设备，其核心优势在于样品用量少（仅需1~20μL）、检测快速、操作便捷，无需复杂的样品预处理。本研究结果表明，该仪器在核酸定量中，线性范围宽、检测限低（0.03~0.05ng/μL）、精密度高（RSD≤2.3%），显著优于传统紫外分光光度法，且抗干扰能力强，可有效避免缓冲液、杂质等对检测结果的影响，这与荧光染料对核酸的特异性结合特性密切相关——荧光染料仅与核酸结合并产生荧光信号，而不与游离核苷酸、蛋白质等杂质结合，从而提高了检测的特异性与准确性。
在蛋白质定量中，博清生物荧光计的检测限（0.03μg/μL）远低于紫外分光光度法（0.2μg/μL），精密度更优，且对复杂样品中的蛋白质检测具有较强的抗干扰能力，可适用于细胞裂解液、组织提取物等复杂样品的蛋白质定量，解决了传统方法在复杂样品检测中准确性不足的问题。这是由于蛋白质定量荧光染料与蛋白质的结合具有高度特异性，可避免Tris-HCl、SDS等常用缓冲液成分的干扰，同时样品用量少，可减少样品浪费，尤其适用于珍贵样品的检测。
在核酸酶活性检测中，博清生物荧光计基于荧光探针法，可实时监测核酸酶降解探针的过程，通过荧光信号的变化精准量化核酸酶活性，检测范围覆盖0.01~10U/mL，检测限低至0.005U/mL，且重复性良好。与传统凝胶电泳法相比，该方法无需凝胶制备、染色、成像等步骤，操作更快速、高效，且可实现定量检测，避免了凝胶电泳法只能定性或半定量的局限；与放射性标记法相比，无放射性污染风险，操作更安全，成本更低，更适合常规实验室应用。此外，该仪器的实时动力学检测模式可直观反映核酸酶的催化动力学过程，为核酸酶的功能研究、抑制剂筛选等提供了有力工具，这与同类荧光检测技术的应用优势一致，同时博清生物荧光计的紧凑型设计的使得其更适合小型实验室或移动检测场景使用。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计在核酸与蛋白定量及核酸酶活性检测中表现出优异的性能，具备灵敏度高、特异性强、操作快速、样品用量少、抗干扰能力强等优势，可有效替代传统检测方法，满足分子生物学研究、生物制品质量控制、临床诊断等领域的检测需求，具有广阔的推广应用前景。
博清生物荧光计可实现dsDNA、ssDNA、RNA及蛋白质的精准定量，线性范围宽、检测限低、精密度高，抗干扰能力强，显著优于传统紫外分光光度法，样品用量仅需1~20μL，检测效率高。
该仪器可基于荧光探针法实现DNaseⅠ、RNase A活性的灵敏检测，实时监测荧光信号变化，精准量化核酸酶活性，检测范围为0.01~10U/mL，检测限低至0.005U/mL，重复性良好，操作便捷、无放射性污染，优于凝胶电泳法。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计可同时满足核酸与蛋白定量、核酸酶活性检测的科研需求，为分子生物学实验提供高效、可靠的检测工具，可广泛应用于基础科研、生物制品研发等领域。
