循环肿瘤DNA（ctDNA）是肿瘤细胞凋亡或坏死时释放到外周血中的DNA片段，携带与原发肿瘤一致的基因突变信息，可无创、实时反映肿瘤的基因状态及演化轨迹，是肿瘤耐药监测的理想生物标志物。荧光定量PCR（qPCR）技术作为分子诊断领域的“黄金标准”，凭借其高灵敏度、高特异性、快速检测的优势，已广泛应用于肿瘤基因检测及耐药监测。博清生物科技（南京）有限公司研发的BOD-96PE荧光定量PCR仪是一款专为科研应用设计的多重荧光定量分析平台，具备六通道荧光检测能力、精准控温系统及智能化操作模式，可实现对低丰度突变基因的高效检测。
一、材料与方法
（一）主要仪器与试剂
仪器：博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪，具备4~6通道荧光检测能力，10寸彩色触摸屏操作，抽屉式样品台设计，控温精度达行业领先水平；数字PCR仪；高速冷冻离心机；核酸提取仪（博清生物BHT-16T）。
试剂：ctDNA提取试剂盒；EGFR T790M、KRAS G12C、PIK3CA E545K突变荧光定量PCR检测试剂盒，均为TaqMan探针法，荧光报告基团分别为FAM、VIC、ROX，淬灭基团为TAMRA；ddPCR检测试剂盒；无酶纯水。
（二）样本采集与处理
分别于患者治疗前（T0）、治疗2周期（T1）、治疗4周期（T2）及疾病进展时（T3）采集外周静脉血10mL，置于EDTA抗凝管中，颠倒混匀后，4℃、3000r/min离心15min，分离上层血浆，置于-80℃冰箱保存备用。采用博清生物BHT-16T核酸提取仪，按照ctDNA提取试剂盒说明书操作，提取血浆中ctDNA，采用荧光计检测ctDNA浓度及纯度，确保A260/A280在1.8~2.0之间，浓度≥10ng/μL。
（三）检测方法
1、博清生物BOD-96PE荧光定量PCR检测
按照荧光定量PCR检测试剂盒说明书配制反应体系，总反应体积为20μL，其中PCR反应液18μL，模板DNA 2μL。设置反应条件：预变性95℃ 5min；变性95℃ 15s，退火延伸60℃ 30s，共40个循环，每个循环结束后采集荧光信号。博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪自带软件进行数据分析，以Ct值≤38为突变阳性，Ct值>38或无扩增曲线为突变阴性[1]。每个样本设置3个复孔，同时设置阳性对照、阴性对照及空白对照，确保实验结果可靠。
2、ddPCR检测（对照方法）
按照ddPCR检测试剂盒说明书配制反应体系，总反应体积为20μL，其中ddPCR反应液18μL，模板DNA 2μL。将反应体系加入微滴生成卡中，加入70μL微滴生成油，置于微滴生成仪中生成微滴，随后转移至96孔PCR板中，密封后进行PCR扩增。扩增条件：预变性95℃ 10min；变性94℃ 30s，退火延伸60℃ 1min，共40个循环；最后98℃ 10min灭活。扩增结束后，采用微滴阅读仪读取微滴信号，以突变 allele frequency（AF）≥0.1%为突变阳性。
二、结果
（一）博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪的检测性能验证
以ddPCR检测结果为金标准，验证博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪检测3种热点耐药突变的性能。结果显示，86例患者治疗各阶段共采集样本344份，博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪检测EGFR T790M、KRAS G12C、PIK3CA E545K突变的灵敏度分别为97.22%（35/36）、95.83%（23/24）、96.43%（27/28），特异性均为100.00%（308/308、320/320、316/316），与ddPCR检测结果的一致性Kappa值分别为0.943、0.917、0.931（P均<0.001），提示博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪检测肿瘤耐药突变的准确性与ddPCR高度一致，且具有良好的灵敏度和特异性。
此外，博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪单次检测可同时完成96个样本的检测，每个样本3个复孔的检测时间约为1.5h，显著短于ddPCR（约3.5h）；仪器采用10寸彩色触摸屏操作，程序设置便捷，抽屉式样品台设计便于样本取放，可有效提高实验效率。
（二）治疗过程中耐药突变的动态变化
86例患者治疗前（T0）共检测出7例（8.14%）耐药突变阳性，其中EGFR T790M突变3例、KRAS G12C突变2例、PIK3CA E545K突变2例；治疗2周期（T1）突变阳性率升高至16.28%（14/86），其中新增EGFR T790M突变4例、KRAS G12C突变2例、PIK3CA E545K突变1例；治疗4周期（T2）突变阳性率进一步升高至34.88%（30/86），较T0、T1阶段显著升高（χ²=18.752、8.364，P均<0.05）；疾病进展时（T3）共检测出77例（89.55%）突变阳性，显著高于T0、T1、T2阶段（χ²=132.645、105.327、68.419，P均<0.001）。
不同肿瘤类型的耐药突变分布存在差异：非小细胞肺癌患者以EGFR T790M突变为主（治疗4周期阳性率45.24%），结直肠癌患者以KRAS G12C突变为主（治疗4周期阳性率39.29%），乳腺癌患者以PIK3CA E545K突变为主（治疗4周期阳性率37.50%），与各肿瘤类型的靶向治疗靶点及耐药机制相符。
（三）耐药突变与临床疗效的相关性
治疗4周期后，86例患者中CR 6例、PR 38例、SD 29例、PD 13例，ORR为51.16%，DCR为84.88%。其中，耐药突变阳性患者30例，ORR为30.77%（9/30），DCR为53.85%（16/30）；耐药突变阴性患者56例，ORR为78.57%（44/56），DCR为95.24%（53/56）。突变阳性患者的ORR、DCR显著低于突变阴性患者（χ²=18.236、26.745，P均<0.001）。
（四）耐药突变与无进展生存期的相关性
随访期间，86例患者均完成随访，中位随访时间为10.5个月。耐药突变阳性患者的中位PFS为5.8个月（95%CI：4.2~7.4个月），显著短于耐药突变阴性患者的11.2个月（95%CI：9.8~12.6个月）（Log-rank χ²=32.874，P<0.001）。提示耐药突变的出现是肿瘤患者靶向治疗疗效不佳、预后不良的重要预测指标。
三、讨论
靶向治疗的精准性依赖于肿瘤基因状态的准确检测，而耐药突变的出现是导致靶向治疗失败的主要原因，因此，建立高效、精准的耐药突变监测方法，对于肿瘤精准诊疗具有重要意义。ctDNA作为一种无创、实时的肿瘤分子标志物，可在治疗过程中动态反映肿瘤的基因变化，为耐药突变监测提供了理想的检测对象。
荧光定量PCR技术是目前ctDNA检测的主流技术之一，其核心原理是将荧光标记技术与PCR扩增过程深度融合，通过动态监测荧光信号强度变化，实现对目标核酸的精准定量。博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪作为国产自主研发的检测设备，具备多项优势：其一，采用集成光路设计，支持最高六通道荧光检测，可兼容大多数荧光染料与探针类型，能够同时检测多种耐药突变，满足多靶点联合监测的需求；其二，配备精密的智能控温系统，采用快速控温算法，可缩短实验运行时间，同时保证控温精度与准确度，减少实验误差；其三，操作便捷，10寸彩色触摸屏支持全触屏操作，新建运行程序快速简便，抽屉式样品台设计易于取放样本，提高操作效率的同时增加实验安全性；其四，检测成本低于ddPCR，更适合基层医疗机构及常规实验室推广应用。
本研究结果显示，博清生物科技（南京）有限公司研发的BOD-96PE荧光定量PCR仪检测EGFR T790M、KRAS G12C、PIK3CA E545K突变的灵敏度均超过95%，特异性达100%，与ddPCR检测结果高度一致（Kappa值均≥0.91），提示该仪器可精准检测ctDNA中的低丰度耐药突变，满足临床监测需求。这与相关研究结果相符，有研究表明， ultrasensitive real-time PCR检测液体活检样本中PIK3CA热点突变的准确性与ddPCR相近，且具有更高的检测效率。
在治疗过程中，耐药突变阳性率呈逐渐升高趋势，疾病进展时突变阳性率高达89.55%，这一结果与肿瘤耐药的发生规律一致——随着靶向治疗的推进，肿瘤细胞逐渐发生基因演化，耐药突变累积，最终导致疾病进展。同时，本研究发现，耐药突变阳性患者的ORR、DCR显著低于突变阴性患者，中位PFS显著缩短，提示博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪监测到的耐药突变状态，可有效预测患者的治疗疗效及预后。此外，该仪器可在治疗早期（2~4周期）检测到耐药突变的出现，较影像学评估（通常需肿瘤体积增大20%以上）提前数周甚至数月预警疾病进展，为临床及时调整治疗方案（如更换靶向药物、联合化疗等）提供可靠依据，避免无效治疗，改善患者生存质量。
不同肿瘤类型的耐药突变分布存在差异，非小细胞肺癌患者以EGFR T790M突变为主，结直肠癌患者以KRAS G12C突变为主，乳腺癌患者以PIK3CA E545K突变为主，这与各肿瘤类型的驱动基因及靶向治疗耐药机制密切相关。博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪支持多通道检测，可根据不同肿瘤类型灵活选择检测靶点，满足个性化监测需求。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的BOD-96PE荧光定量PCR仪具有高灵敏度、高特异性、操作便捷、检测高效的优势，可精准监测肿瘤患者靶向治疗过程中ctDNA耐药突变的动态变化，为临床疗效评估、治疗方案调整及预后判断提供可靠的分子生物学依据，符合肿瘤精准诊疗的发展趋势，具有重要的临床推广应用价值。
