单克隆抗体（mAb）凭借特异性强、纯度高、可无限扩增等优势，广泛应用于分子诊断、蛋白互作研究、治疗药物开发、抗原表位鉴定等生物科研领域。经典杂交瘤抗体制备流程包含小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤培养、阳性克隆筛选、亚克隆纯化、腹水大量制备及抗体鉴定，其中抗体效价筛选是筛选高分泌、高特异性杂交瘤细胞的关键限速步骤。间接 ELISA 法因操作简便、灵敏度高、适合批量样本检测，成为单抗效价检测金标准，其核心设备为微孔板酶标仪，仪器的吸光度检测稳定性、最低检出限、控温与振板功能直接影响阳性克隆漏筛、假阳性概率。
目前国内科研实验室多依赖进口多功能酶标仪完成 ELISA 检测，设备采购与维护成本高昂；国产酶标仪在光路精度、交叉干扰抑制、高通量数据处理软件上仍存在性能差异。博清生物科技（南京）有限公司自主研发WKB-96微孔板酶标仪，集成光吸收检测、恒温孵育、自动进出仓、全板自动校准功能，专为免疫 ELISA 高通量筛选设计，具备低交叉干扰、宽线性动态范围、高重复性等特点，但该设备在单克隆抗体制备全流程效价筛选中的系统性应用数据仍较为匮乏。
一、材料与仪器
（一）实验材料
重组新冠 N 蛋白抗原（实验室原核表达纯化，纯度＞95%）；6～8 周龄 SPF 级 BALB/c 雌性小鼠；SP2/0 骨髓瘤细胞；HAT 选择性培养基、HT 培养基、DMEM 高糖培养基、胎牛血清；包被液（0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.6）；封闭液（5% 脱脂牛奶 - PBST）；PBST 洗涤液；HRP 标记羊抗鼠 IgG 二抗；TMB 显色底物；2 mol/L H₂SO₄终止液；96 孔可拆卸 ELISA 酶标板；细胞培养 96 孔板。
（二）主要仪器
博清生物WKB-96微孔板酶标仪；CO₂细胞培养箱；倒置生物显微镜；高速冷冻离心机；超净工作台；恒温摇床；微量移液器；全自动洗板机。
二、实验方法
（一）重组抗原免疫小鼠与免疫血清效价初筛
将重组 N 蛋白抗原与弗氏佐剂等体积乳化，免疫 5 只 BALB/c 小鼠，每只皮下多点注射，间隔 14 d 加强免疫，共免疫 3 次。三免 7 d 后尾静脉采血，分离血清，采用间接 ELISA 检测血清效价，博清 WKB-96 读取 OD₄₅₀值。
ELISA 流程：抗原 1 μg/mL 4℃包被酶标板过夜；5% 脱脂奶 37℃封闭 1 h；血清 10 倍梯度倍比稀释（1:100～1:102400），37℃孵育 1 h；PBST 洗涤 3 次；HRP 二抗 1:5000 稀释，37℃孵育 45 min；TMB 避光显色 10 min；硫酸终止，酶标仪读取 OD₄₅₀，以 OD₄₅₀/ 阴性孔 OD≥2.1 判定为阳性，最大阳性稀释倍数为血清效价。选取血清效价≥1:51200 小鼠进行细胞融合。
（二）杂交瘤细胞融合与初筛
无菌取免疫小鼠脾脏制备脾细胞，与 SP2/0 骨髓瘤细胞以 20:1 比例 PEG 介导融合，铺于 96 孔细胞培养板，HAT 培养基筛选培养。融合第 10 天，显微镜观察细胞克隆生长，吸取细胞上清进行间接 ELISA 初筛，博清 WKB-96 一次性完成整块 96 孔板读数，软件自动计算 P/N 值，标记阳性孔（P/N≥2.1）。
（三）有限稀释亚克隆复筛
将初筛阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行三轮亚克隆，每轮亚克隆培养 7～10 d 后取上清 ELISA 检测，WKB-96 批量读取多块酶标板吸光度，筛选单克隆生长、上清高效价稳定细胞株，淘汰弱阳性、多克隆混合孔。
（四）腹水制备与纯化抗体效价检测
稳定杂交瘤细胞扩大培养，BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油预处理7d后注射杂交瘤细胞，14d后收集腹水；腹水经 Protein A 亲和层析纯化，倍比稀释后间接 ELISA 检测纯化抗体效价，博清酶标仪完成梯度稀释样品定量，自动拟合效价曲线。
（五）博清 WKB-96 酶标仪性能验证实验
1、重复性试验：同一阳性、阴性、临界值样品各 20 复孔，同一块酶标板连续检测，计算吸光度变异系数 CV；
2、线性范围验证：梯度稀释标准阳性抗体，0～3.0 Abs 区间检测，拟合线性回归方程，计算 R²；
3、高通量效率对比：分别使用博清 WKB-96、传统单通道分光光度计、进口品牌酶标仪检测 3 块 96 孔 ELISA 板，记录总检测耗时；
4、温控稳定性验证：设置 37℃恒温孵育模块，连续 2 h 监测板内温度波动，评估显色反应均一性。
三、实验结果
（一）WKB-96 酶标仪性能评价结果
1、重复性：高、中、低吸光度样本批内 CV 分别为 1.62%、2.15%、2.78%，均低于仪器标称 3% 阈值，孔间交叉干扰极低，无边缘效应；
2、线性关系：抗体梯度稀释吸光度 0～2.8 Abs 区间线性回归 R²=0.9996，宽动态范围可同时检测高稀释腹水与低浓度细胞上清，无信号饱和；
3、检测效率：单块96孔板读板时间仅28s，3块板完整检测含数据导出总耗时5min；传统单通道分光光度计同等样本检测耗时62min，进口多功能酶标仪耗时11min，博清 WKB-96检测效率优势显著；
4、温控性能：37℃恒温模块板内温差≤±0.3℃，显色反应孔间颜色均一，消除温度不均导致的假阳性/假阴性误差。
（二）免疫小鼠血清效价初筛结果
5 只免疫小鼠血清经博清 WKB-96 检测，3 只小鼠血清效价达到 1:51200 以上，最高达 1:102400，P/N 值稳定＞4.5，选取该小鼠脾细胞开展细胞融合，仪器批量读数快速完成 5 份血清梯度稀释样本定量，数据自动导出无需人工计算。
（三）杂交瘤融合初筛与亚克隆筛选结果
细胞融合共铺 12 块 96 孔细胞板，融合后可见克隆生长孔共 826 孔，经 WKB-96 一次性批量读板，初筛阳性孔 117 孔，阳性克隆率 14.16%；经三轮有限稀释亚克隆复筛，剔除多克隆、弱阳性不稳定孔，最终获得 6 株单克隆稳定杂交瘤细胞株，编号 N-1F4、N-2D7、N-3B9、N-4E2、N-5C6、N-6G8。
细胞上清效价检测结果：6 株细胞上清倍比稀释检测，最高效价为 N-2D7 株 1:12800，最低 N-5C6 株 1:3200；博清配套软件自动生成每株细胞稀释梯度 OD 曲线，直观区分高低效价克隆，大幅降低人工统计工作量。
（四）腹水纯化单克隆抗体效价鉴定
6 株杂交瘤细胞诱导小鼠腹水，Protein A 纯化后抗体浓度 1.2～3.1 mg/mL，经 WKB-96 ELISA 检测腹水效价：N-2D7 株腹水效价最高，达 1:512000；其余 5 株腹水效价介于 1:64000～1:256000 之间，所有单抗与无关抗原无交叉反应，特异性良好。梯度稀释吸光度曲线平滑无跳点，证明仪器弱信号检测灵敏度满足超高稀释倍数腹水样本检测需求。
（五）国产博清酶标仪与进口设备对比
同等实验条件下，进口酶标仪与 WKB-96 检测同批次 ELISA 板，阳性孔 P/N 值偏差＜0.08，效价判定结果完全一致；但博清设备采购成本仅为进口设备 60%，配套分析软件免费开放，长期使用成本更低，适配中小型科研实验室、高校抗体平台高通量筛选需求。
四、讨论
单克隆抗体制备中，杂交瘤细胞上清效价筛选属于大样本、多批次重复性 ELISA 实验，仪器检测稳定性直接决定阳性克隆筛选准确率。传统单通道分光光度计单孔依次读数，通量极低，细胞融合数百孔样本检测耗时过长，显色底物易超时失效，造成实验误差；部分低价国产酶标仪存在孔间重复性差、边缘效应明显、线性区间窄、温控缺失等缺陷，高浓度腹水样本易出现信号饱和，低浓度细胞上清弱信号检出能力不足，易漏筛潜在高价值杂交瘤细胞株。
本研究使用博清生物 WKB-96 酶标仪完成单抗制备全流程效价筛选，其核心优势体现在三方面：
（一）高精度光路抑制检测误差：顶部共聚焦读取光路降低孔间交叉干扰，吸光度重复性 CV＜2.8%，0～3.0 Abs 宽线性区间，可同步检测 ng 级细胞上清与高浓度腹水样本，兼顾弱信号与强信号定量；
（二）集成化功能适配 ELISA 筛选全流程：内置 37℃精准温控与多级振板，可实现酶标板板内同步孵育，减少恒温箱转移操作带来的污染与温度波动；自动进出仓、快速读板大幅提升 96 孔批量样本检测效率；配套软件内置单抗效价专用分析模块，自动计算 P/N 值、判定阳性阈值、拟合稀释梯度曲线，省去人工 Excel 统计，降低人为计算错误；
（三）国产化高性价比：检测性能对标进口主流微孔板检测仪，但设备采购、维护成本显著降低，无软件使用授权费，适合高校、科研院所抗体研发平台规模化推广，助力免疫检测仪器国产化替代。
本研究建立标准化的 “博清 WKB-96 酶标仪 - 间接 ELISA” 单抗效价高通量筛选方案，完整覆盖小鼠免疫预筛选、杂交瘤初筛、亚克隆复筛、腹水抗体鉴定全流程，为国产酶标仪在抗体工程科研领域的标准化应用提供完整实验数据支撑。
博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96微孔板酶标仪吸光度检测重复性佳、线性范围宽、温控稳定、高通量检测效率突出，可精准完成单克隆抗体制备全流程间接 ELISA 效价筛选，准确区分高、低效价杂交瘤细胞株，最终获得 6 株稳定分泌抗 N 蛋白特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，纯化腹水最高效价达 1:512000。该设备检测性能与进口同类设备无显著差异，采购与使用成本更低，可完全替代进口酶标仪用于生物科研中单克隆抗体高通量效价筛选工作，具备良好的实验室推广应用价值。
