转录组测序（RNA-seq）技术凭借其高分辨率、高通量的优势，已广泛应用于基因表达定量、可变剪接分析、新基因挖掘等生物科研领域，成为解析生命活动分子机制的核心工具。RNA-seq实验流程涵盖样本采集、RNA提取、质量验证、文库构建、测序及数据分析等关键环节，其中文库构建前的RNA质量验证是保障测序数据可靠性的前提条件。低质量RNA（如降解、污染或纯度不足）会导致基因表达定量偏差、基因覆盖度不均，甚至无法有效区分可变剪接转录本，严重影响后续研究结论的准确性。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、样本来源：选取小鼠肝脏组织、人外周血单个核细胞（PBMC）及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，共计30份，其中新鲜样本20份，FFPE样本10份。所有样本均按照标准流程采集，新鲜样本采集后立即置于RNA稳定剂（RNA Later™）中，-80℃保存；FFPE样本脱蜡后备用。
2、主要试剂与仪器：总RNA提取试剂盒；RNA纯度与浓度检测试剂盒；琼脂糖；TAE缓冲液（1×）；Loading Buffer（RNA专用）；DNA Marker（100~10000 bp）。核心仪器包括博清生物酶标仪；生物分析仪；紫外分光光度计；高速冷冻离心机；琼脂糖凝胶电泳仪。
（二）实验方法
1、RNA提取
新鲜小鼠肝脏组织与PBMC样本按照Trizol®试剂说明书提取总RNA：取50mg组织或1×10⁶个细胞，加入1mL Trizol试剂充分研磨/裂解，室温静置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min；4℃、12000r/min离心15min，吸取上层水相至新离心管；加入500μL异丙醇，混匀后室温静置10min；4℃、12000r/min离心10min，弃上清；加入1mL 75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，4℃、7500r/min离心5min，弃上清；室温晾干沉淀，加入20~50μL DEPC水溶解RNA，-80℃保存备用。FFPE样本采用专用RNA提取试剂盒（Zymo Research）提取，严格按照说明书操作，去除石蜡残留与蛋白质污染。
2、博清生物酶标仪检测RNA浓度与纯度
取提取的RNA样本，用DEPC水进行10倍稀释（避免浓度过高超出仪器检测线性范围）。设置实验分组：空白对照组（DEPC水）、标准品组（Qubit™ RNA标准品，浓度梯度0~100ng/μL）与样本组，每组3个生物学重复。将稀释后的样本与试剂按照试剂盒说明书混合，加入96孔板（每孔10μL），密封后室温避光孵育5min。
二、结果与分析
（一）博清生物酶标仪检测RNA浓度与纯度的重复性
对30份RNA样本进行3次重复检测，结果显示，博清生物酶标仪检测的RNA浓度、OD260/280及OD260/230比值的变异系数（CV）均<5%，其中新鲜样本浓度检测CV值为1.2%~3.8%，FFPE样本为2.1%~4.5%；纯度比值检测CV值均<3%，表明该仪器检测重复性良好，可满足科研实验对数据稳定性的要求。
（二）博清生物酶标仪与传统检测方法的结果相关性
1、浓度与纯度检测相关性：博清生物酶标仪与紫外分光光度计检测的RNA浓度呈显著正相关（r=0.982，P<0.001），其中新鲜样本相关性（r=0.991）高于FFPE样本（r=0.965）；两者检测的OD260/280比值相关系数为0.973（P<0.001），OD260/230比值相关系数为0.968（P<0.001），表明博清生物酶标仪检测结果与传统紫外分光光度计具有高度一致性，检测准确性可靠。
2、完整性辅助验证结果：琼脂糖凝胶电泳显示，博清生物酶标仪检测合格的样本（纯度比值符合标准）均呈现清晰的28S与18S rRNA条带，且28S/18S比值≥1.5，无明显降解条带（smearing）；不合格样本则出现条带模糊、降解严重或基因组污染（高分子量条带）现象。生物分析仪检测结果显示，合格样本RIN值均≥7.0（新鲜样本RIN≥8.0，FFPE样本RIN≥6.0），与博清生物酶标仪纯度检测结果高度匹配，表明博清生物酶标仪可通过纯度指标间接反映RNA完整性，为样本筛选提供有效依据。
（三）质量验证结果对RNA-seq数据质量的影响
测序数据质量分析显示，博清生物酶标仪筛选的合格样本测序数据Q30碱基比例均≥85%，基因覆盖度均匀（覆盖度偏差<10%），基因表达定量结果与已知生物学规律一致；而不合格样本Q30碱基比例≤75%，基因覆盖度不均，部分低表达基因无法有效检测，且表达定量偏差显著（P<0.05）。此外，FFPE样本中，博清生物酶标仪检测的OD260/230比值≥1.8且浓度≥40ng/μL时，文库构建成功率达90%，显著高于比值<1.8样本（成功率40%），表明该仪器可有效筛选出适合RNA-seq的低质量样本（如FFPE），降低实验成本。
三、讨论
RNA-seq文库构建前的质量验证是保障转录组学研究可靠性的关键环节，其核心在于快速、准确地评估RNA样本的浓度、纯度与完整性，剔除不合格样本以避免下游实验失败或数据偏差。本研究证实，博清生物酶标仪在RNA质量验证中具备显著优势，其双模式检测（紫外+荧光）可同时实现浓度定量与纯度评估，且检测通量高（96孔板单次可检测80个样本），相较于传统单样本检测的紫外分光光度计，效率提升8~10倍，适合批量样本处理的科研场景。
纯度检测方面，OD260/280比值是评估蛋白质污染的核心指标，理想范围为1.8~2.0，比值过高（>2.0）可能提示RNA降解或游离核苷酸污染，比值过低（<1.8）则表明存在蛋白质残留；OD260/230比值≥1.8可排除酚类、盐类等有机杂质污染，这些杂质会抑制逆转录酶与DNA聚合酶活性，影响文库构建效率。本研究中，博清生物酶标仪检测的纯度比值与Nanodrop 2000高度一致，且能有效区分污染样本，为后续实验提供了可靠的纯度筛选标准。
完整性评估方面，传统方法依赖琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪，但酶标仪无法直接检测RIN值或28S/18S比值。本研究发现，博清生物酶标仪检测的纯度比值与RNA完整性存在显著关联：纯度比值符合标准的样本，其28S/18S比值与RIN值均满足RNA-seq要求，这可能是因为RNA降解过程中会伴随碱基暴露，导致紫外吸收光谱偏移，进而影响纯度比值。因此，在缺乏生物分析仪等专用设备的实验室，可通过博清生物酶标仪检测纯度与浓度，结合琼脂糖凝胶电泳快速评估RNA完整性，建立简化的质量验证流程。
对于FFPE等特殊样本，其RNA因固定与储存过程易发生降解，质量验证难度较大。本研究发现，博清生物酶标仪检测的浓度≥40ng/μL、OD260/230≥1.8时，FFPE样本文库构建成功率显著提升，这是因为FFPE样本中残留的石蜡与甲醛衍生物会影响核酸检测，更高的浓度与纯度可降低杂质干扰，提示针对特殊样本需适当提高质量筛选标准。
博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪在RNA-seq文库构建前的RNA质量验证中表现出良好的准确性、重复性与高通量优势，其检测的RNA浓度（≥20ng/μL，新鲜样本；≥40ng/μL，FFPE样本）、OD260/280比值（1.8~2.0）与OD260/230比值（≥1.8）可作为样本筛选的核心标准。结合琼脂糖凝胶电泳辅助验证完整性，该仪器可有效剔除降解或污染样本，保障RNA-seq数据的可靠性，降低实验成本与风险。本研究为生物科研与实验室研究中RNA质量控制提供了实用技术方案，推动了博清生物酶标仪在转录组学研究中的规范化应用。
