一、研究背景
畜禽疫病（如非洲猪瘟、禽流感、蓝耳病等）具有传播速度快、致死率高、经济损失大等特点，严重威胁畜牧业安全生产与公共卫生安全。传统诊断方法中，病毒分离培养操作复杂、耗时久（2-7天），难以满足疫情应急处置需求；胶体金免疫层析法虽快速简便，但灵敏度较低，易出现漏检；实时荧光定量PCR（qPCR）灵敏度与特异性较高，但依赖专业实验室与操作人员，设备成本高，不适用于基层现场检测。因此，开发兼具高灵敏度、高特异性与便携性的快速诊断技术，成为农业生物技术领域的研究热点。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计基于先进的生物荧光检测技术，整合微型光学系统、恒温扩增模块与智能数据分析模块，可实现病原体核酸或抗原的快速定量检测。
二、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器设备：博清生物荧光计；实时荧光定量PCR仪；胶体金检测试剂盒；高速冷冻离心机。
2、试剂与样本：目标病原体标准品；非目标病原体（猪瘟病毒、新城疫病毒等5种）；临床样本共362份（包括猪血清186份、鸡咽拭子124份、猪组织匀浆52份，采集某规模化养殖场）；荧光探针（特异性针对目标病原体基因保守区）；恒温扩增试剂。
（二）检测原理
博清生物荧光计采用荧光共振能量转移技术，当特异性荧光探针与目标病原体核酸（或抗原）结合后，探针构象发生改变，激发光能量从供体荧光基团转移至受体荧光基团，产生特异性荧光信号。仪器通过微型光学传感器捕捉荧光强度变化，结合内置标准曲线，实现目标病原体的定量检测，检测结果以“阳性/阴性”及核酸拷贝数呈现。
（三）实验方法
1、样本处理
血清样本室温静置30min后，8000r/min离心5min取上清；组织匀浆样本按1:5比例加入生理盐水研磨，10000r/min离心10min取上清；咽拭子样本置于含3mL PBS缓冲液的离心管中，振荡10min后取上清。所有样本均采用核酸提取试剂盒（磁珠法）提取核酸，操作按试剂盒说明书进行。
2、检测体系优化
以ASFV为模型，优化荧光探针浓度（0.2-1.0μmol/L）、扩增温度（60-65℃）、反应时间（20-40min）等参数，以荧光信号强度、检测限为评价指标，确定最佳反应条件。
3、性能评价实验
灵敏度检测：将目标病原体标准品进行10倍梯度稀释（10⁶-10⁰copies/μL），分别采用博清生物荧光计、qPCR仪、胶体金试剂盒进行检测，记录最低检测限。
特异性检测：采用优化后的检测体系，对5种非目标病原体及3种目标病原体进行检测，验证仪器特异性。
检测速度对比：统计3种方法从样本处理到获得结果的总时间。
临床样本验证：采用3种方法对362份临床样本进行平行检测，以qPCR检测结果为金标准，计算博清生物荧光计的检测符合率、灵敏度、特异度。
三、结果与分析
（一）检测体系优化结果
当荧光探针浓度为0.6μmol/L、扩增温度为63℃、反应时间为30min时，博清生物荧光计对ASFV标准品的荧光信号强度最高，背景噪音最低，确定为最佳反应条件。
（二）灵敏度检测结果
博清生物荧光计对ASFV、AIV-H9、PRRSV的最低检测限均为10¹copies/μL，qPCR仪检测限为10⁰copies/μL，胶体金试剂盒检测限为10³copies/μL。博清生物荧光计灵敏度虽略低于qPCR，但较胶体金方法提升100倍。
（三）特异性检测结果
博清生物荧光计仅对ASFV、AIV-H9、PRRSV产生特异性荧光信号，与猪瘟病毒、新城疫病毒等5种非目标病原体无交叉反应，特异性达100%，与qPCR检测结果一致。
（四）检测速度对比结果
博清生物荧光计单个样本从处理到出结果的总时间为35min，其中样本处理15min、扩增检测20min；qPCR总时间为90min（样本处理30min、扩增检测60min）；胶体金总时间为25min，但需手动判读结果，主观性较强。
（五）临床样本验证结果
362份临床样本中，qPCR检测阳性128份、阴性234份。博清生物荧光计检测阳性126份、阴性236份，与qPCR检测结果的总符合率为98.2%（356/362），灵敏度为98.4%（126/128），特异度为98.3%（230/234），与胶体金方法（符合率91.7%）相比差异具有统计学意义（χ²=18.36，P<0.01）。
四、讨论
本研究构建的博清生物荧光计畜禽疫病检测体系，通过优化反应参数，实现了对ASFV、AIV-H9、PRRSV等常见疫病的快速精准检测。结果显示，该仪器灵敏度较胶体金方法大幅提升，接近qPCR水平，可有效减少漏检风险；特异性达100%，避免了交叉反应导致的误判，为疫情精准防控提供可靠依据。
在检测效率方面，博清生物荧光计将单个样本检测周期控制在35min内，较传统qPCR缩短60%以上，且无需专业实验室环境，仪器重量仅0.5kg，配备触摸屏操作界面与蓝牙数据传输功能，适合养殖场现场快速筛查与基层防疫部门移动检测。此外，该仪器采用一次性反应芯片，避免交叉污染，检测成本仅为qPCR的1/3，符合规模化养殖与基层防疫的成本控制需求。
与现有研究相比，本研究首次系统验证了博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计在多种畜禽疫病诊断中的应用性能，覆盖猪、禽等主要养殖品种，临床样本量较大，结果可靠性更高。但本研究仅针对3种常见疫病，后续可扩展至牛、羊等畜禽疫病检测，进一步优化多通道检测模块，实现多种病原体的同步筛查。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计凭借高灵敏度、高特异性、快速便捷、成本可控等优势，在畜禽疫病诊断中表现出良好的应用前景。该仪器可有效解决传统诊断方法在基层应用中的痛点，为畜牧业疫病早发现、早处置提供技术支撑，对保障畜牧业健康发展与公共卫生安全具有重要意义。未来可通过技术迭代，进一步提升多病原体同步检测能力，拓展在畜禽疫病流行病学调查中的应用场景。
