缺血性脑损伤是由脑血管阻塞导致脑组织缺氧、缺血引发的神经功能障碍，具有高发病率、高致残率的特点，其病理机制及治疗靶点研究依赖稳定的体外模型。体外细胞模型构建的核心在于精准模拟体内缺血微环境，其中缺氧（低氧浓度）和酸碱平衡（CO₂浓度调控）的稳定维持是关键因素。
传统普通培养箱仅能调控CO₂浓度和温度，无法实现低氧环境的精准、持续控制，导致缺血模型稳定性差、实验重复性低，制约了研究进展。博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱可同时精准调控O₂、CO₂和N₂浓度，结合高精度控温系统，能模拟不同缺血程度的微环境，为缺血性脑损伤细胞模型的标准化构建提供可能。本研究以大鼠皮层神经元为研究对象，系统评估博清生物三气培养箱在缺血性脑损伤模型构建中的应用效果，为神经科学研究提供实验支撑。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、细胞：新生SD大鼠皮层神经元（分离自出生24h内大鼠）；
2、仪器：博清生物三气培养箱、普通CO₂培养箱、倒置显微镜、酶标仪、电泳系统、免疫荧光显微镜；
3、试剂：神经元专用培养基、胎牛血清、CCK-8试剂盒、LDH释放检测试剂盒、Annexin V - FITC/PI凋亡检测试剂盒、Caspase-3抗体、β-actin 抗体、二抗等。
（二）实验分组
1、正常对照组：神经元在常规培养环境（21% O₂、5% CO₂、37℃）中培养；
2、缺血模型组（博清生物三气培养箱组）：神经元在模拟缺血环境（1% O₂、5% CO₂、94% N₂、37℃）中培养；
3、对照组（普通培养箱组）：尝试通过密封培养瓶减少氧气接触模拟缺血，其余条件同正常对照组。
（三）实验方法
1、大鼠皮层神经元分离与培养
新生SD大鼠消毒后取大脑皮层，剥离脑膜，剪碎组织后用胰蛋白酶消化，终止消化后吹打制成单细胞悬液，经筛网过滤后接种于包被多聚赖氨酸的培养板中，加入神经元专用培养基，置于常规培养环境中培养3d后更换培养基，培养7d用于后续实验。
2、缺血性脑损伤模型构建
神经元培养至第7天，缺血模型组转移至博清生物三气培养箱中，设置参数为1% O₂、5% CO₂、37℃，持续培养6h构建缺血损伤模型；对照组在普通培养箱中，将培养瓶密封后培养6h；正常对照组继续常规培养6h。
3、指标检测
细胞活力检测：采用CCK-8法，模型构建后向各孔加入CCK-8试剂，孵育2h后用酶标仪检测450nm处吸光度值，计算细胞活力；
细胞损伤检测：采用 LDH 释放法，收集培养上清液，按照试剂盒说明书操作，检测490nm处吸光度值，评估细胞膜损伤程度；
细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双染法，收集细胞后加入染色液孵育15min，流式细胞仪检测凋亡率；
蛋白表达检测：采用Western blot法，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，加入Caspase-3和β-actin一抗孵育过夜，二抗孵育后显影，Image J软件分析蛋白条带灰度值。
（四）统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以“平均值±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
二、结果
（一）细胞活力变化
正常对照组细胞活力为（98.6±2.3）%；缺血模型组（博清生物三气培养箱组）细胞活力显著下降至（42.3±3.5）%；对照组（普通培养箱组）细胞活力为（78.5±4.2）%。缺血模型组细胞活力显著低于正常对照组和对照组（P<0.05），且组内数据差异较小（变异系数<5%），对照组数据波动较大（变异系数>10%）。
（二）细胞膜损伤程度
正常对照组LDH释放率为（12.5±1.8）%；缺血模型组LDH释放率显著升高至（68.7±4.1）%；对照组LDH释放率为（35.2±5.3）%。缺血模型组LDH释放率显著高于其他两组（P<0.05），且结果稳定性优于对照组。
（三）细胞凋亡率变化
正常对照组细胞凋亡率为（3.2±0.8）%；缺血模型组凋亡率显著升高至（45.6±3.2）%；对照组凋亡率为（18.9±4.5）%。缺血模型组凋亡率显著高于正常对照组和对照组（P<0.05），且实验重复性良好。
（四）Caspase-3蛋白表达
与正常对照组相比，缺血模型组Caspase-3蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）；对照组Caspase-3蛋白表达虽有升高，但幅度显著低于缺血模型组，且组间差异较大。
三、讨论
缺血性脑损伤的核心病理环节是缺氧引发的神经元损伤与凋亡，体外模型需精准复现这一核心特征。本研究中，博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱通过精准调控O₂浓度至1%，成功模拟了脑缺血后的缺氧微环境，诱导神经元出现明显的活力下降、细胞膜损伤及凋亡增加，且Caspase-3蛋白表达显著升高，这些变化与体内缺血性脑损伤的病理特征高度一致。
相比之下，普通培养箱通过密封方式模拟缺血，无法精准控制氧浓度，导致模型组细胞损伤程度较轻且结果波动较大，难以满足科研实验对稳定性和重复性的要求。博清生物三气培养箱的优势体现在三个方面：一是氧浓度调控精度高（0.1%~21%），可根据实验需求设置不同低氧梯度，适配不同缺血程度的模型构建；二是三气（O₂、CO₂、N₂）协同调控，维持细胞培养环境的酸碱平衡和渗透压稳定，减少非特异性损伤；三是控温精度达±0.1℃，避免温度波动对细胞状态的影响，进一步提升实验重复性。
本研究证实，博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱构建的缺血性脑损伤细胞模型更贴近体内病理状态，且具有良好的稳定性和重复性，可为缺血性脑损伤的分子机制研究、药物筛选及疗效评估提供可靠的实验平台。后续研究可利用该仪器探索不同缺血时间、不同氧浓度对神经元损伤的影响，进一步优化模型构建方案。
博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱通过精准调控低氧环境，成功构建了稳定、可靠的缺血性脑损伤神经元模型，其诱导的细胞损伤和凋亡特征更贴近体内病理状态，显著优于传统普通培养箱的模拟方法。该仪器为神经科学领域中缺血性脑损伤的体外研究提供了高质量的实验工具，具有重要的科研应用价值。
