活性氧包括过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基等多种物质，主要来源于线粒体呼吸链、NADPH 氧化酶等通路。生理条件下ROS作为第二信使参与细胞增殖、分化、免疫应答信号调控；当外界药物、毒物、缺氧刺激下ROS大量累积，会诱发脂质过氧化、DNA损伤、线粒体功能紊乱，进一步启动细胞凋亡、焦亡等程序性死亡通路。因此精准定量胞内ROS水平，是解析细胞应激响应、化合物药理毒性、疾病细胞模型表型的关键实验环节。
当前ROS主流检测手段包含流式细胞术、荧光显微镜、荧光酶标仪等。流式细胞术可实现单细胞水平分析，但设备成本高，样本前处理繁琐；荧光显微镜侧重形态观察，精确定量能力有限；酶标仪适合多孔板高通量，但部分低丰度样本信号信噪比不足。博清生物科技（南京）有限公司研发的YQG‑01X便携式荧光计采用专用荧光检测光路，支持1‑20 μL微量样本检测，双通道荧光采集，5寸触控交互，兼容DCF荧光检测体系，可对细胞裂解上清中DCF荧光信号进行快速读取，弥补传统设备在小样本、低通量科研样本检测中的应用短板，适用于细胞功能研究中ROS批量样本定量分析。
一、材料与方法
（一）仪器与试剂
1、仪器：博清生物YQG‑01X荧光计；CO₂细胞培养箱；高速冷冻离心机；超净工作台；恒温水浴锅。
2、试剂：DCFH‑DA活性氧荧光探针；H₂O₂（ROS 阳性诱导剂）；N‑乙酰半胱氨酸 NAC（抗氧化抑制剂）；细胞完全培养基；PBS缓冲液；细胞裂解液。
3、细胞模型：选用贴壁培养哺乳动物细胞，设置正常对照组、H₂O₂氧化损伤模型组、NAC 预处理保护组。
（二）实验原理
DCFH‑DA本身无荧光，脂溶性分子自由穿透细胞膜，胞内酯酶水解去除乙酸基团生成DCFH，DCFH极性增强被截留于胞质内；胞内ROS将DCFH氧化生成具有绿色荧光的DCF，DCF激发波长485 nm，发射波长525 nm，荧光强度与胞内ROS含量呈正相关。收集细胞并裂解，取上清样本置于博清生物荧光计专用PCR管中，设置对应激发、发射参数采集荧光读数，扣除空白本底后计算各组相对ROS水平。
计算公式：相对ROS水平=（样本荧光值‑空白荧光值）/（正常对照组荧光值‑空白荧光值）×100%
（三）实验步骤
1、细胞铺板与处理：细胞接种培养，待生长至合适汇合度；分组设置对照组、H₂O₂损伤组、NAC预处理 + H₂O₂干预组，按照实验方案进行药物刺激处理。
2、DCFH‑DA探针孵育：弃培养基，PBS清洗细胞，加入稀释后的DCFH‑DA工作液，37 ℃避光孵育20‑30 min，PBS充分洗涤去除未进入细胞的游离探针，全程避光操作，防止探针光氧化淬灭。
3、细胞裂解获取样本：加入细胞裂解液充分裂解细胞，离心去除细胞碎片，吸取上清作为待测样本。
4、荧光计检测：取5‑15 μL待测上清样本加入0.5 mL PCR反应管，放入博清生物YQG‑01X荧光计样品槽，设置检测通道匹配DCF荧光信号，5 s完成信号读取，记录荧光强度数值；同步设置空白裂解液空白管，消除试剂本底荧光干扰。
5、方法学验证：设置重复样本，计算组内变异系数；设置H₂O₂浓度梯度，验证荧光信号随ROS水平升高的线性响应；同时设置无探针细胞样本，扣除细胞自发荧光干扰。
二、结果与分析
（一）博清生物荧光计对DCF荧光信号检测性能
博清生物YQG‑01X荧光计针对DCF荧光信号具备良好响应，微量样本5‑15 μL即可完成检测，无需大体积样本，节约珍贵细胞样本。重复样本检测组内变异系数小，检测结果稳定，能够区分梯度浓度DCF标准品荧光信号，线性相关性良好，满足ROS相对定量的实验需求。仪器操作流程简单，无需复杂调试，触摸屏直接读取荧光数值，缩短检测周期，避免探针长时间放置造成荧光淬灭带来的实验误差。
（二）不同处理组细胞ROS相对水平
与正常对照组相比，H₂O₂氧化损伤模型组细胞ROS相对水平显著升高，提示外源刺激诱导胞内活性氧大量生成，细胞发生明显氧化应激损伤；经NAC抗氧化剂预处理后，ROS水平较损伤模型组显著回落，证明抗氧化药物有效清除胞内ROS，缓解氧化应激状态。该检测结果与文献报道的氧化应激模型变化趋势一致，博清生物荧光计可清晰捕捉三组样本ROS水平差异，实现细胞氧化应激状态的有效判别。
（三）方法优势与实验注意事项
相较于流式细胞仪，本方案无需制备单细胞悬液，通过细胞裂解上清检测，适合贴壁细胞样本；对比荧光酶标仪，仅需微量样本，适合样本量有限的细胞功能实验。
实验关键控制点：①DCFH‑DA探针易光氧化，孵育、样本制备、检测全程避光；②必须设置空白本底、无探针细胞对照，消除试剂与细胞自发荧光造成假阳性；③探针孵育时间不宜过长，避免探针自身氧化抬高基线；④细胞裂解充分，去除沉淀杂质，防止杂质散射光干扰荧光计检测信号。
三、讨论
ROS介导的氧化应激贯穿细胞增殖、凋亡、衰老、炎症反应等众多生物学过程，精准定量胞内ROS是细胞功能研究的重要技术基础。DCFH‑DA荧光探针法是细胞ROS检测最普遍的技术手段，但是检测设备的性能直接决定数据可靠性。博清生物YQG‑01X荧光计基于固态荧光检测光路，适配DCF荧光检测体系，微量进样、快速读数，兼顾检测灵敏度与操作便捷性，在细胞裂解样本ROS定量中表现出良好重复性。
该方案适用于多种细胞功能研究场景：可用于筛选抗氧化活性化合物，评价药物诱导细胞氧化损伤程度；研究线粒体功能异常状态下活性氧释放水平；解析基因过表达/敲除后细胞氧化应激表型变化。该荧光计不局限于DCFH‑DA体系，也可兼容其他多种荧光探针，拓展至线粒体膜电位、钙离子等其他细胞功能指标的检测，一台仪器实现多类细胞氧化还原相关指标测定，降低实验室设备配置成本。
本方法为相对定量方法，适合组间ROS水平对比分析；若需要绝对浓度标定，可搭配 H₂O₂标准品建立标准曲线进行换算。同时实验中需要完善对照设置，规避DCFH‑DA探针非特异性氧化带来的结果偏差，与细胞活力、MDA、SOD等氧化应激相关指标联合验证，提升实验结论严谨性。
博清生物科技（南京）有限公司研发的YQG‑01X荧光计结合DCFH‑DA探针的细胞ROS定量检测方法，能够稳定检测不同处理条件下细胞的活性氧水平，有效识别细胞氧化应激状态。该检测方案样本用量少、检测速度快、操作门槛低，数据重复性佳，可广泛应用于细胞氧化应激、药物毒性评价、细胞功能机制探索等科研工作，为生命科学基础研究提供经济实用的荧光定量检测解决方案。
