随着合成生物学技术快速发展，酿酒酵母、毕赤酵母等工程菌株被广泛用于重组酶、药用蛋白、萜类、谷胱甘肽等功能产物的异源合成，高密度培养是实现产物高效合成的基础手段。酵母高密度培养过程中，菌体耗氧速率高，溶解氧不足会触发厌氧代谢，大量生成乙醇、乙酸等抑制性副产物，制约菌体密度进一步提升；CO₂分压变化会改变培养基 pH，影响胞内代谢通路活性；温度波动、杂菌污染也会造成批次间数据差异大、实验失败率高等问题。
常规摇瓶培养仅依靠表层通气，氧供给能力有限，仅适合低生物量种子培养；普通二氧化碳培养箱仅可调控 CO₂，无法实现氧浓度的主动下调，难以模拟微需氧、限氧等多样化培养条件；传统厌氧罐气体配比精度差，环境稳定性不足，不适合酵母工程菌高密度条件下多批次平行筛选实验。博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱依托红外气体检测、PID 闭环控制技术，可独立调节 O₂、CO₂浓度，氮气作为平衡气动态补偿，搭配高精度温控与无菌防护系统，能够构建稳定可控的微生物气体微环境，为酵母工程菌高密度预培养、菌株表型验证、代谢条件优化提供全新解决方案。
一、材料与设备
（一）实验菌株与培养基
实验菌株：重组毕赤酵母GS115工程菌、酿酒酵母合成生物学改造菌株。
培养基：YPD基础培养基，补料高密度培养基；根据实验需求添加筛选抗生素；培养基pH预先调节至5.5‑6.0，121℃高压蒸汽灭菌备用。
（二）主要仪器
博清生物ZJS‑160‑J三气培养箱；高速冷冻离心机；紫外‑可见分光光度计；生物安全柜；高压灭菌锅。
设备核心性能：O₂范围1-95VOL%，CO₂范围0‑20VOL%，气体控制精度±0.1%；温度控制范围 RT+3~60℃，温度均匀度≤±0.3℃；304不锈钢半圆角内胆，HEPA高效过滤，紫外灭菌，开门自动停止循环风扇，降低气体外泄与杂菌污染风险，支持多段程序控温控气，可存储多组培养程序。
二、实验方法
（一）种子液制备
挑取工程菌单菌落，接种至液体种子培养基，摇瓶预培养至对数生长期，测定OD₆₀₀，按接种量10%（v/v）转接至无菌摇瓶，放置于三气培养箱内部摇床托架开展静态/振荡高密度培养。
（二）分组培养条件设置
对照组：常规摇瓶，30℃，空气环境，摇床转速220 r/min；
实验组（博清生物三气培养箱）：温度恒定30℃；设置梯度氧浓度（10%‑20% O₂），CO₂ 2‑5%，N₂做平衡补偿；摇床转速220r/min，分批次培养与补料高密度培养两组平行，每组设置3生物学重复。
培养过程定时取样，测定OD₆₀₀、菌体湿重，检测发酵液乙醇含量，统计菌体生长曲线，对比不同气体条件下菌体最大生物量、副产物积累水平。
三、结果与分析
（一）气体环境对酵母工程菌生长及生物量的影响
对照组常规摇瓶培养受限于氧传递效率，随着菌体浓度升高，溶氧快速下降，Crabtree 效应显著，乙醇快速累积，菌体OD₆₀₀最高仅可达85‑105，菌体湿重增长提前进入平台期，批次之间结果波动较大。
在博清生物三气培养箱可控气体环境下，通过精准维持适宜氧分压，改善体系氧供给，有效抑制溢流代谢，乙醇副产物含量显著下降；工程菌对数生长期延长，补料条件下OD₆₀₀最高可达210‑245，菌体湿重大幅提升；多组平行样品之间重复性显著优于传统摇瓶体系。设备气体闭环控制系统可以稳定维持箱内O₂、CO₂设定值，开门恢复后气体浓度快速回稳，减少环境扰动对高密度菌体生长带来的负面影响。
（二）CO₂分压对酵母工程菌代谢的调控作用
酵母高密度培养后期菌体代谢释放大量CO₂，箱内CO₂累积会改变培养基pH，干扰胞内酶活。三气培养箱可主动设定CO₂浓度阈值，动态平衡箱内气体组分，避免CO₂过度蓄积，维持培养基pH相对稳定，保障高密度状态下酵母工程菌细胞完整度，降低细胞裂解死亡比例，有利于重组蛋白、次级代谢产物的合成积累。
（三）设备无菌体系对高密度长时间培养的保障
酵母高密度培养周期较长，极易发生杂菌污染。博清生物三气培养箱内胆采用无死角304不锈钢结构，搭配HEPA气体过滤系统与紫外灭菌功能，进气空气经过滤除菌；开门时循环风扇自动停机，减少外界杂菌侵入，长时间高密度培养过程染菌风险显著降低，适合多批次、高通量工程菌筛选预培养工作。
四、讨论
酵母工程菌高密度培养的核心瓶颈集中在溶解氧供给、代谢副产物抑制、环境参数波动三大方面，传统摇瓶只能依靠转速、装液量被动改善供氧，无法主动调节氧分压，很难开展限氧、微需氧条件下的菌株表型研究，也难以实现多组气体条件的平行对照实验。
博清生物三气培养箱通过O₂‑CO₂‑N₂三气协同闭环调控，能够精准模拟不同氧分压的培养微环境，在小试层面完成酵母工程菌高密度预培养、代谢表型筛选、气体胁迫条件下菌株耐受性评估，提前获取最优氧、CO₂工艺参数，为后续发酵罐放大生产提供前期参考数据。相较于发酵罐，三气培养箱可同时开展多组平行条件对比，操作简便，耗材成本更低，适合合成生物学实验室菌株构建后的初筛工作。
同时在实际使用中需要注意：高密度振荡培养需选用挡板摇瓶，控制装液比例；箱体提前预运行，待气体、温度参数完全稳定后放入样品；尽量减少开门频次，降低气体扰动；定期开展箱体灭菌维护，规避杂菌污染。
博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱可以实现氧气、二氧化碳的高精度独立调控，搭配稳定温控与无菌防护体系，用于酵母工程菌高密度培养，能够有效缓解Crabtree效应，减少乙醇等抑制性副产物积累，提高菌体生物量，提升平行实验的重复性与可靠性。该设备弥补了传统摇瓶、普通CO₂培养箱在微生物气体环境调控上的短板，适用于酿酒酵母、毕赤酵母等工程菌的菌株筛选、代谢条件优化、高密度预培养等合成生物学研究场景，为酵母底盘细胞生物制造的前期研发提供有力的实验装备支撑。
