绝大多数细胞生理过程并非由单一蛋白独立完成，而是依靠多种蛋白组装形成功能复合物执行生物学功能。转录复合体、信号小体、修复复合体等，均依赖蛋白之间特异性识别、结合、组装形成多聚蛋白复合物。解析蛋白复合物的形成条件、结合强弱，是解析蛋白功能、挖掘疾病靶点、开展药物分子筛选的重要前提。
当前蛋白复合物验证主流手段包括免疫共沉淀（Co‑IP）、Pull‑down、酵母双杂交等。Co‑IP 可以验证细胞内生理条件下蛋白复合物，但操作周期长，样本处理量大，以定性结果为主，定量能力弱；Pull‑down 适合体外重组蛋白互作验证，但单批次样本数量受限，不适合大样本梯度条件筛选；SPR 等分子互作仪设备成本高，对操作人员要求较高。
基于微孔板的固相免疫结合实验，借助酶标仪可以实现高通量的蛋白复合物体外验证。将诱饵蛋白固定于酶标板固相载体，加入候选互作蛋白，孵育后若二者发生特异性结合，即可形成蛋白复合物；经过充分洗板去除未结合游离蛋白，通过特异性抗体识别复合物组分，结合酶促显色或者荧光信号，由酶标仪读取信号强度，信号高低反映蛋白复合物形成量的多少。博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB‑96酶标仪集成化学发光检测模式，搭载高精度温控模块，可适配终点检测与动力学检测，能够满足蛋白复合物验证实验的多维度检测需求，弥补传统验证方法通量不足、定量困难的短板，适合实验室常规开展蛋白复合物体外验证实验。
一、材料与仪器
（一）实验材料
纯化重组诱饵蛋白 A、候选互作蛋白 B；蛋白包被缓冲液；封闭液；PBST 洗涤缓冲液；靶蛋白特异性一抗；HRP 标记二抗；TMB 显色底物；终止液；96 孔高结合力酶标板；蛋白酶抑制剂。设置空白对照组、诱饵蛋白单一组、候选蛋白单一组、无关蛋白阴性对照组。
（二）仪器设备
博清生物WKB‑96酶标仪；高速冷冻离心机；微孔板振荡器；恒温孵育箱；微量移液器。博清生物WKB‑96酶标仪具备线性PMT检测技术，支持吸光度、荧光强度检测，内置温控模块，温度区间室温‑45℃，支持终点读数、动力学读数，兼容96孔微孔板，自动光路校准，有效降低孔间交叉干扰，保障蛋白结合信号检测的稳定性与重复性。
二、实验原理
将诱饵蛋白固定在 96 孔酶标板孔底，封闭非特异性结合位点；加入梯度浓度候选互作蛋白 B，适宜温度孵育，若 A、B 存在特异性相互作用，孔内固相上形成 A‑B 蛋白复合物；充分洗板去除未结合的游离蛋白 B。加入识别蛋白 B 的特异性一抗，再加入 HRP 标记二抗，加入 TMB 底物发生酶促显色反应，复合物含量越高，显色产物越多。使用博清生物酶标仪测定 450 nm 处吸光度 OD 值，OD 数值高低代表蛋白复合物形成水平。阴性对照组无明显信号，实验组 OD 显著高于阴性对照，证明两种蛋白可以组装形成蛋白复合物。同时设置不同蛋白浓度、孵育温度、缓冲盐离子条件，可探究影响蛋白复合物组装的环境条件，实现半定量评估蛋白结合能力。
三、实验方法
（一）蛋白包被：使用包被缓冲液稀释诱饵蛋白 A，加入 96 孔板，每孔 100 μL，4℃过夜包被。弃去包被液，PBST 洗涤 3 次。加入封闭液室温封闭 2 h，封闭微孔板空白位点，降低非特异性吸附。弃封闭液，PBST 洗涤 3 次。
（二）蛋白复合物组装孵育：实验组加入梯度稀释的候选蛋白 B；对照组分别设置不加蛋白 B、加入无关对照蛋白；每孔体系 100 μL。微孔板置于博清酶标仪温控模块，设置 30℃孵育 1.5 h，促进蛋白分子相互识别组装形成复合物。孵育结束，充分洗板 5 次，彻底洗去未结合游离蛋白。
（三）抗体孵育显色：加入稀释好的蛋白 B 特异性一抗，室温孵育 1 h；洗板后加入 HRP 标记二抗，室温孵育 1 h；再次充分洗涤。每孔加入 TMB 显色底物，避光显色，加入终止液终止酶促反应。
（四）信号读取：将微孔板放入博清生物 WKB‑96 酶标仪，选择吸光度检测模式，读取 450 nm 吸光度 OD 值。软件自动导出各孔原始数据，扣除空白孔背景，计算校正 OD 值。以校正 OD 值表征蛋白复合物形成量。
（五）条件梯度实验：改变候选蛋白 B 浓度、孵育温度、缓冲液离子强度，重复上述实验，分析不同条件对蛋白复合物组装效率的影响。
四、实验结果与分析
（一）蛋白复合物形成验证结果
阴性对照组（无关蛋白、无诱饵蛋白组）校正 OD 值维持在较低水平，非特异性吸附背景信号低。加入诱饵蛋白 A 与候选蛋白 B 共同孵育的实验组校正 OD 显著高于阴性对照组，说明诱饵蛋白 A 可以捕获候选蛋白 B，二者体外条件下能够特异性结合，成功组装形成蛋白复合物。
随着候选蛋白 B 浓度升高，校正 OD 值逐步上升，到达一定浓度后信号趋于平台，提示诱饵蛋白结合位点趋于饱和，蛋白复合物组装达到最大水平。博清生物酶标仪稳定读出梯度变化信号，组内重复孔 CV 值小于 3%，证明检测重复性良好。
（二）孵育条件对复合物组装的影响
利用酶标仪内置温控功能，设置 25℃、30℃、37℃不同孵育温度开展平行实验。结果显示温度变化显著影响 OD 读数，反映蛋白复合物组装效率受温度调控；缓冲液盐离子浓度改变同样会造成信号波动，提示该蛋白复合物的形成依赖适宜的离子环境。博清酶标仪集成温控，无需外置孵育箱，减少微孔板转移带来的误差，提升条件筛选实验可靠性。
（三）方法学对比
相较于 Co‑IP 与 Pull‑down，本套基于博清酶标仪的微孔板验证方案，单块 96 孔板可同时完成多组浓度梯度、多组对照、多条件平行样本，样本消耗量更低；可以直接输出定量信号，直观反映复合物形成相对水平；操作流程简单，适合候选互作蛋白初筛。该方法属于体外固相检测，适合初筛验证，获得阳性结果后，建议结合 Co‑IP 等细胞内实验进一步确认生理条件下蛋白复合物的真实存在。
五、讨论
蛋白复合物组装是生命科学研究的核心方向，体外验证蛋白能否形成复合物是后续功能研究的基础工作。传统互作验证手段偏向定性，高通量筛选成本高。博清生物 WKB‑96 酶标仪依托多模式检测、精准温控、高通量微孔板读取能力，结合固相 ELISA 策略，可以高效完成蛋白复合物形成的体外验证，得到相对定量数据，同时完成孵育温度、蛋白浓度、缓冲条件等多参数筛选，为后续亲和力测定、突变体互作能力对比、小分子抑制剂筛选提供实验基础。
在实际实验中需要关注非特异性吸附干扰，充分封闭、严谨设置对照组，区分真实特异性复合物信号与蛋白非特异吸附。该体系既可以采用比色法，也可以切换荧光检测模式，进一步提升检测灵敏度，适合低丰度蛋白复合物检测。
博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪可应用于蛋白复合物体外形成验证实验，依托 96 孔高通量检测，能够定量读取蛋白复合物结合信号，评估蛋白之间结合能力，同时完成孵育温度、蛋白浓度等条件筛选。该方案操作简便、样本消耗少、重复性好，可作为蛋白‑蛋白相互作用初筛的有力工具，与Co‑IP、Pull‑down等经典技术互为补充，服务于蛋白功能、分子机制、药物靶点筛选等生物科研工作。
