严格厌氧及兼性厌氧微生物具备独特的厌氧代谢通路，在无氧条件下可完成有机酸、醇类、生物高分子、功能蛋白的生物合成，是绿色生物制造的核心底盘细胞。随着 CRISPR‑Cas、同源重组、接合转移等基因编辑工具不断成熟，对厌氧底盘开展基因敲除、基因过表达、代谢通路重构已经成为主流研究手段。但绝大多数厌氧工程菌对氧气高度敏感，微量氧气即可造成菌体氧化损伤、启动子诱导失效、异源蛋白表达量下降，直接导致实验数据失真、菌株筛选失败。
传统厌氧培养手段中，厌氧罐气体配比精度低，开盖取样后厌氧环境重建慢；厌氧手套箱设备投入高、维护复杂，难以满足大批量平板与液体培养同步开展的科研需求。三气培养箱通过精准调控 O₂、CO₂、N₂三种气体组分，可快速构建严格厌氧、微氧、高二氧化碳等多种气体环境，兼顾平板固体培养与摇瓶液体厌氧培养，是厌氧合成生物学的关键设备。博清生物科技（南京）有限公司研发的ZJS系列三气培养箱依托高精度传感器与三气联动配比系统，可将箱内氧浓度稳定控制至 0.1% 以下，同时完成温度、湿度、气体的闭环控制，适配厌氧基因工程菌从转化复苏、阳性克隆筛选到厌氧诱导表达的完整实验链条，有效解决厌氧微生物基因工程研究中的环境控制痛点。
一、厌氧基因工程菌构建与表达技术流程
厌氧基因工程菌的完整实验流程包含目的基因获取、重组载体构建、底盘菌株转化、厌氧条件下阳性菌株筛选、厌氧诱导表达、产物检测六大环节，每一步均需要规避氧气干扰。
（一）重组表达载体构建
根据研究目标，扩增目的功能基因，选用适配厌氧底盘的穿梭质粒，选择nirB、fnrS、pflB等厌氧诱导型启动子，控制下游目的基因的转录翻译，通过 Gibson 组装、酶切连接完成重组载体构建，测序验证载体序列完全正确后，制备质粒备用。针对梭菌等严格厌氧底盘，载体需携带接合转移元件，为后续质粒导入宿主做准备。
（二）底盘菌株转化与复苏
以厌氧改造大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌、产乙酸菌等为底盘，采用电转化或大肠杆菌接合转移方式将重组质粒导入厌氧宿主菌。转化完成后，快速将复苏培养基或者复苏平板转移至博清生物三气培养箱内，设置培养条件：温度 37 ℃，O₂＜0.1%，CO₂5%，剩余由 N₂补足，进行复苏培养，避免操作过程中氧气造成转化子死亡。
（三）阳性转化子厌氧筛选
复苏结束后，涂布对应抗性的固体平板，放入三气培养箱中恒温厌氧培养。平板培养阶段需要维持箱内严格厌氧环境，持续抑制氧气渗入，保证携带重组质粒的阳性克隆正常生长，淘汰氧敏感的阴性菌株。挑取单菌落接种至液体厌氧培养基，在同一厌氧环境中扩大培养，完成初级菌株保藏。该步骤中，培养箱气体稳定性直接决定阳性克隆的获得率。
（四）厌氧诱导异源基因表达
将验证正确的工程菌接种至厌氧液体培养基，在三气培养箱内进行预培养，待菌体生长至对数生长期，添加诱导物启动厌氧启动子，开启目的基因表达。依据菌株代谢特性调整温度、气体配比，分别采集不同时间梯度菌体样本，用于后续菌体生长测定、蛋白电泳、代谢产物定量分析。
（五）产物与表型检测
收集厌氧培养后的菌体，检测 OD₆₀₀反映菌体生长情况；通过 SDS‑PAGE、Western‑blot 检测异源蛋白表达水平；利用高效液相色谱检测发酵产物组分与产量，综合评价基因工程菌的改造效果。
二、博清生物三气培养箱适配厌氧工程菌实验的设备特性
博清生物 ZJS‑80‑J、ZJS‑160‑J 三气培养箱专为微生物与细胞厌氧、低氧培养设计，可无缝对接厌氧基因工程菌构建‑表达全流程，核心性能如下：
（一）三气精准联动控制系统：搭载高精度氧、二氧化碳传感器，氮气自动补偿，氧浓度可稳定达到 0.1% 以下，满足严格厌氧菌培养；CO₂浓度 0‑20% 连续可调，自动配比 N₂补足剩余组分，无需人工计算气体比例，气体波动小，避免因氧浓度漂移造成厌氧启动子诱导异常，保障异源基因表达重复性。箱门关闭后可快速恢复预设厌氧参数，减少样品进出带来的环境干扰。
（二）高精度恒温恒湿体系：控温区间室温 + 3 ℃～60 ℃，温度波动≤±0.2 ℃，箱内温度场均匀，平板与液体摇瓶培养时各处培养条件一致，减少因温度不均造成克隆生长差异，适合大批量转化子筛选。可控湿度可减少平板培养基失水干裂，延长厌氧平板培养周期。
（三）内腔洁净与污染防控：内腔采用不锈钢材质，配备紫外杀菌模块与 HEPA 高效过滤系统，可降低箱内杂菌污染风险。厌氧基因工程菌多携带抗性标记，一旦发生杂菌污染会直接造成假阳性结果，洁净环境保障筛选结果真实可靠。
（四）多规格样品兼容：内部可灵活放置培养皿、厌氧试管、厌氧摇瓶，固体平板筛选和液体厌氧诱导表达可同步开展；7 寸触摸屏直观显示温度、O₂、CO₂、湿度实时数据，支持参数超限声光报警，实验异常及时提示，降低厌氧实验失败风险。
（五）使用成本优势：对比传统厌氧手套箱，设备占地更小，操作简便，无需复杂的手套维护、催化剂再生流程，适合合成生物学实验室开展大量厌氧基因工程菌株的平行筛选实验。
三、应用实例：厌氧诱导型启动子调控工程菌异源表达
以携带nirB厌氧诱导启动子的重组厌氧大肠杆菌工程菌为研究对象，分别使用博清生物 ZJS‑160‑J 三气培养箱与传统厌氧罐开展平行对照实验。
实验条件：培养温度 37 ℃，严格厌氧（O₂＜0.1%），CO₂5%。实验组放置于三气培养箱；对照组使用厌氧罐进行相同菌株培养。
实验结果显示：博清生物三气培养箱组，工程菌生长稳定，OD₆₀₀可达 1.42，厌氧启动子正常激活，目的蛋白高效表达，平行样品之间生长量、蛋白表达量偏差小于 5%；厌氧罐组，受罐内残余氧气、气体分布不均影响，平行样本离散度大，部分菌体生长受抑制，蛋白表达量波动明显。结果证实，三气培养箱稳定的厌氧微环境，能够充分发挥厌氧启动子调控功能，真实反映基因工程菌的表达表型，减少假阴性实验结果。
同时针对梭菌严格厌氧底盘开展测试，重组梭菌接合转移后的转化子在三气培养箱厌氧条件下生长良好，阳性克隆检出率明显高于厌氧罐，可完成批量菌株筛选，为通路改造后的梭菌工程菌表型验证提供稳定平台。
四、实验关键注意事项
（一）培养基预处理：严格厌氧菌所用固体、液体培养基建议提前预还原，降低培养基内部溶解氧，与三气培养箱的外部厌氧环境协同，进一步减少氧气对工程菌的损伤。
（二）样品操作：样品转移尽量快速，减少在空气中暴露时间；频繁取样时，尽量减少箱门开启频次，避免大量空气进入腔体，开启后等待设备完成气体重建再继续培养。
（三）设备维护：定期校验氧气、二氧化碳传感器，保证气体读数准确；定期执行腔体灭菌，防止交叉污染；HEPA 过滤器按周期维护，维持内腔洁净度。
（四）对照设置：厌氧基因工程菌实验需设置野生型菌株、空载体对照，放置于同一台三气培养箱内同步培养，消除设备环境带来的系统误差。
厌氧基因工程菌的表型高度依赖培养环境中的氧气水平，环境氧的微小波动会直接改变菌体代谢模式，造成基因表达水平偏移，干扰基因编辑效果的评价。博清生物科技（南京）有限公司研发的ZJS系列三气培养箱依靠稳定可控的三气配比、精准温控、洁净内腔，打通厌氧基因工程菌从载体构建、转化复苏、阳性克隆筛选到厌氧诱导表达的全链条，弥补传统厌氧罐、手套箱的短板，实现固体平板筛选与液体表达同步开展，提升厌氧合成生物学实验的通量与可重复性。
