转录因子通过识别基因启动子/增强子区域保守顺式作用元件，介导RNA聚合酶招募，决定靶基因时空表达模式。转录因子从细胞质转位入核并获得DNA结合能力，是信号通路向下游传递信号的标志性过程。准确测定核提取物中转录因子的功能性DNA结合活性，区别于仅检测蛋白表达量的Western blot，能够直接反映转录因子真实功能状态。
目前转录因子DNA结合活性主流检测方法包括EMSA、染色质免疫共沉淀（ChIP）、双荧光素酶报告实验与微孔板显色法。EMSA只能定性或半定量、样本处理繁琐，无法实现高通量筛选；ChIP多用于体内结合验证，操作周期长；报告基因实验反映细胞整体转录水平，不能直接测定蛋白 - DNA体外结合亲和力。基于微孔板的DPI-ELISA检测方法，以非放射性探针捕获活化转录因子，依靠酶促显色反应实现信号放大，配合高性能微孔板读数设备，非常适合批量样本定量分析。
微孔板吸光度信号采集设备的稳定性、波长精度、孔间均一性直接决定最终定量数据可靠性。博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪，集成可见光比色检测模块，支持终点法与动力学检测，适配常规96孔细胞培养板与结合实验微孔板，广泛应用于免疫检测、酶活分析、分子互作研究。
一、材料与方法
（一）实验仪器
博清生物多功能全自动酶标仪；高速冷冻离心机；恒温孵育箱；博清生物单道可调移液器；微孔板振荡器；超净工作台；-80℃超低温冰箱。
（二）实验试剂与样本
人源巨噬细胞RAW264.7细胞；核蛋白提取试剂盒；NF-κB p65转录因子DNA结合活性检测试剂盒（DPI-ELISA法，含链霉亲和素预包被96孔板、生物素标记野生型κB保守序列双链DNA探针、突变型阴性对照探针、特异性一抗、HRP标记二抗、TMB显色底物、终止液、封闭液、洗涤缓冲液）；LPS刺激剂；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂混合液。
（三）核蛋白样本制备
对照组细胞正常培养，实验组使用LPS诱导NF-κB通路激活。弃培养液，PBS清洗细胞，按照试剂盒说明书提取细胞核蛋白；BCA法测定蛋白浓度，统一蛋白浓度后分装，-80℃保存，避免反复冻融。
（四）DPI-ELISA检测转录因子DNA结合活性
1、微孔板封闭：预包被链霉亲和素 96 孔板加入封闭液，室温封闭 1 h，洗涤 3 次；
2、探针 - 蛋白结合反应：每孔加入结合缓冲液、生物素标记野生型双链 DNA 探针；设置阴性对照孔（加入突变序列探针）、空白对照；随后加入等量核蛋白样本，室温温和振荡孵育 60 min，活化转录因子与探针特异性结合；
3、洗板去除未结合蛋白；加入抗 NF-κB p65 特异性一抗，室温孵育 1 h；充分洗涤；
4、加入 HRP 标记二抗，室温孵育 40 min；洗涤去除游离二抗；
5、加入 TMB 显色液，避光室温显色 10 min；加入硫酸终止液终止显色反应；
6、立即将微孔板置于博清生物酶标仪中，设置检测波长 450 nm，参比波长 630 nm，读取各孔吸光度 OD₄₅₀数值。
（五）仪器性能评估指标
利用博清生物酶标仪采集数据，计算组内重复孔平均值、标准差、变异系数（CV）；设置梯度核蛋白样本，分析OD值与蛋白剂量相关性；比较野生探针组与突变探针组信号差异，评价检测特异性。
二、实验结果
（一）LPS 诱导显著提升 NF-κB p65 DNA 结合活性
博清生物酶标仪采集结果显示：LPS刺激组核蛋白样本OD₄₅₀显著高于空白对照组（P<0.01），提示炎症刺激促使NF-κB p65入核并获得DNA结合能力；突变探针阴性对照组OD值维持在低水平，无明显信号上升，证明转录因子与DNA序列结合具有高度序列特异性，非特异性结合信号较低，实验体系可靠。
（二）博清生物酶标仪检测重复性评估
同一批次样本设置6个复孔，通过酶标仪连续3次读数。结果显示，实验体系批内变异系数CV＜6.5%；微孔板边缘孔与中心孔数值无显著差异，证实博清生物酶标仪微孔板光路均一性良好，有效降低边缘效应带来的检测偏差，满足定量实验重复性要求。
（三）OD 值与核蛋白浓度呈良好线性相关
梯度稀释核提取物进行结合实验，博清生物酶标仪测得OD₄₅₀信号随核蛋白浓度升高逐步上升，在实验浓度区间内线性相关性良好，说明该设备具备充足动态检测范围，可用于转录因子结合亲和力梯度分析、竞争性结合实验。
（四）高通量检测适用性
整套 DPI-ELISA 反应在 96 孔板内同步完成，单块微孔板可同时容纳多组刺激条件、梯度药物浓度、空白与阴性对照。博清生物酶标仪快速完成整块微孔板扫描读数，十几分钟完成全部样本数据输出，相较于逐样本电泳的 EMSA，检测通量提升数倍，适合转录调控小分子抑制剂大规模筛选工作。
三、讨论
转录因子 DNA 结合活性是连接细胞信号与基因转录的关键功能指标，体外定量检测体系的建立对免疫炎症、肿瘤发生、干细胞分化、代谢调控等方向研究具有重要价值。传统 EMSA 技术局限明显，难以适配现代科研中大样本量、量化分析、药物高通量筛选的需求；基于微孔板的 DPI-ELISA 方案操作简便、无放射性污染，是替代传统凝胶阻滞实验的优选技术路线。
检测仪器是整套定量体系的硬件核心。本研究证实，博清生物多功能酶标仪可见光检测模块波长精准、读数稳定、孔间误差小，能够精准捕捉TMB显色产生的微弱吸光度差异，稳定区分转录因子结合活性的细微变化。设备兼容标准96孔微孔板，支持终点法采集模式，操作界面简洁，适配实验室常规分子生物学人员使用。同时设备支持动力学读数模式，后续可拓展用于实时监测DNA - 转录因子结合解离动态过程。
在实验优化层面，研究过程中发现：封闭条件、洗涤次数、显色时长均会影响背景信号；突变探针对照组必不可少，用于扣除非特异性蛋白吸附造成的基线数值。依托博清生物酶标仪稳定的检测性能，后续可进一步开展竞争性寡核苷酸抑制实验、不同修饰形式转录因子（磷酸化、乙酰化）DNA结合能力对比实验。
本研究仅选用NF-κB p65作为模型转录因子，该检测平台与博清生物酶标仪搭配方案具备通用性，更换对应保守DNA探针与特异性抗体，即可拓展至STAT、CREB、AP-1、FOXO、HSF等几乎所有主流转录因子DNA结合活性检测。
本研究建立基于DPI-ELISA的转录因子DNA结合活性定量检测方法，成功验证博清生物多功能酶标仪在该类分子互作实验中的应用价值。博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪光学性能稳定、重复性优良、支持高通量微孔板检测，可精准定量活化转录因子与靶DNA序列结合水平，克服EMSA 通量低、定量困难的短板。整套实验方案操作安全、无放射性、易于标准化，适用于转录因子功能机制探究、信号通路验证、转录调控活性化合物高通量筛选，可为细胞分子生物学、药理学相关科研工作提供可靠的检测硬件支撑。
