免疫细胞活化是机体抵御病原体感染、肿瘤发生、自身免疫损伤的核心生物学过程。巨噬细胞经脂多糖（LPS）刺激后发生M1型极化，大量释放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子；CD4⁺/CD8⁺ T细胞经抗原共刺激后快速增殖，分泌IFN-γ、IL-2介导细胞免疫杀伤；树突状细胞活化成熟后高表达共刺激分子并分泌趋化因子，启动抗原递呈通路PMC。精准量化上述活化特征是解析免疫调控靶点、筛选免疫佐剂、评估免疫药物活性的必备实验手段。
目前免疫细胞活化主流体外检测技术均依托96/384微孔板读数设备：CCK-8比色法检测细胞增殖活力、夹心ELISA定量培养上清细胞因子、化学发光法检测活化细胞释放 ROS、时间分辨荧光定量低丰度细胞分泌蛋白原创力文档。市场进口酶标仪购置与维护成本高，国产基础酶标仪普遍缺少同步发光检测、恒温孵育、宽动态线性检测能力，多指标联用实验需分设备多次上机，引入操作误差、延长实验周期。
博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96酶标仪为国产化一体化微孔板检测平台，搭载线性PMT光电检测系统、双激发光源补偿技术、内置精准温控孵育模块，兼容化学发光，内置线性拟合、对数拟合、指数拟合、多项式拟合、四参数 Logistic 曲线拟合、批量统计学计算功能，适配高通量免疫细胞活化批量样本检测生物器材网。
一、材料与方法
（一）实验仪器与试剂
1、检测仪器
实验组：博清生物酶标仪，化学发光检测模块，温控区间室温~45℃，自动进出板，自动光路校准；
对照组：进口微孔板读数仪；
辅助设备：CO₂细胞培养箱、超净工作台、高速低温离心机、倒置生物显微镜、96 孔细胞培养板、96 孔 ELISA 包被板、白色发光检测板。
2、细胞与刺激试剂
小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7；小鼠脾脏原代T淋巴细胞；LPS（大肠杆菌O111:B4）；CD3/CD28 共刺激抗体；CCK-8 细胞增殖试剂盒；小鼠 TNF-α、IFN-γ、IL-2 夹心 ELISA 试剂盒；ROS 化学发光检测试剂盒；RPMI 1640 完全培养基、胎牛血清、双抗。
（二）免疫细胞活化体外模型构建
1、LPS 诱导巨噬细胞活化模型
RAW264.7 细胞以 1×10⁵ cells/孔接种 96 孔培养板，设置梯度 LPS 刺激浓度（0、0.1、1、10、100 μg/mL），37℃ 5% CO₂孵育 24 h；分为三组检测：①CCK-8 增殖活力；②收集细胞上清 ELISA 检测 TNF-α、IL-6；③白色微孔板负载细胞进行 ROS 化学发光读数，每组 6 复孔。
2、CD3/CD28 共刺激原代 T 细胞活化模型
分离小鼠脾脏原代淋巴细胞，1.5×10⁵cells/孔铺板，加入CD3（1 μg/mL）+CD28（0.5 μg/mL）共刺激组合，空白对照组不加刺激抗体，培养 48 h；CCK-8 检测 T 细胞增殖，上清 ELISA 定量 IFN-γ、IL-2 分泌水平，评估 T 细胞活化程度。
（三）基于博清 WKB-96 酶标仪的多指标检测方法
1、CCK-8 细胞增殖比色检测
细胞刺激培养结束后，每孔加入10μL CCK-8 工作液，37℃内置温控模块避光孵育 2 h；WKB-96 设置单波长450nm读数，参比波长630nm扣除背景，软件自动导出 OD 值，细胞活力=刺激组OD均值/空白对照组OD均值×100%。
按照 ELISA 试剂盒说明书完成包被、封闭、样本孵育、酶标二抗结合、TMB显色；终止液终止反应后，WKB-96双波长450nm/630nm读取吸光度；软件内置四参数拟合标准曲线，自动换算上清细胞因子浓度，批量导出各组浓度数据并计算标准差、P 值。设备自动校准光路，消除边缘孔温度不均带来的检测偏差。
3、活化细胞ROS化学发光检测
活化巨噬细胞转移至白色不透光 96 孔发光板，加入发光底物试剂，WKB-96 切换化学发光检测模式，PMT 增益自动适配低信号样本，动力学模式连续记录 0~30 min 发光值，以发光总积分表征细胞氧化应激活化水平，反映巨噬细胞早期活化信号强度。
（四）仪器性能评价指标
以免疫细胞活化实验常用样本验证仪器关键性能：①重复性：同一块ELISA标准品连续10次读数，计算批内变异系数CV；②线性范围：梯度稀释TNF-α标准品（0~2000 pg/mL）测定吸光度，判定线性相关系数 R²；③检测下限：空白孔均值 + 3 倍标准差对应细胞因子浓度；④多模式联用稳定性：同一批细胞样本依次完成比色、发光读数，对比数据波动幅度。
二、实验结果
（一）博清 WKB-96 酶标仪核心检测性能验证
性能测试结果显示，WKB-96 吸光度分辨率达 0.0001 Abs，吸光度区间 0.000~4.000 Abs，适配高密度增殖细胞高 OD 样本与低丰度细胞因子低 OD 样本；同一样本连续 10 次读数批内 CV≤0.18%，优于行业通用≤0.2% 质控标准；TNF-α 标准品 0~1500 pg/mL 区间线性相关系数 R²=0.9997，宽动态范围可覆盖静息/高度活化两类细胞上清样本；细胞因子检测下限达 2.3 pg/mL，可精准捕捉弱刺激条件下免疫细胞微量细胞因子分泌；化学发光模式信号无交叉孔渗漏干扰，96 孔一次性完成全部动力学读数，全程耗时≤8 min，自动化程度显著降低人工操作误差。
（二）WKB-96 检测巨噬细胞 LPS 活化增殖与细胞因子分泌
随 LPS 刺激浓度升高，RAW264.7 细胞 OD₄₅₀值呈剂量依赖性上升，10 μg/mL LPS 组细胞活力较空白对照组提升 78.6%（P<0.001），高浓度 100 μg/mL LPS 出现轻度细胞毒性，活力小幅下降，WKB-96 稳定区分各组细微 OD 差异。
ELISA定量结果显示，空白对照组上清TNF-α、IL-6浓度处于基线水平；1 μg/mL LPS 即可显著诱导促炎因子分泌，10μg/mL为最佳活化浓度，TNF-α浓度达1168.4±42.7 pg/mL；设备四参数曲线拟合精准，复孔数据离散度极低，可清晰区分梯度刺激带来的细胞因子分泌差异。
ROS 化学发光动力学曲线显示，LPS活化组发光积分较对照组提升5.2倍，巨噬细胞活化早期氧化应激信号可被WKB-96发光模块灵敏捕获，实现细胞活化早期信号、中期增殖、晚期细胞因子分泌全时序多维度表征。
（三）WKB-96 检测原代 T 细胞共刺激活化表型
CD3/CD28 共刺激 48h 后，T 细胞 CCK-8 OD 值显著高于空白对照组（P<0.0001），提示 T 细胞成功活化增殖；ELISA 检测结果显示，活化组 IL-2、IFN-γ 大量分泌，空白对照组几乎无特异性细胞因子检出。WKB-96 双波长读数有效消除细胞上清内杂质基质带来的背景干扰，原代细胞低丰度细胞因子样本仍具备可靠检出能力，适配原代免疫细胞、原代 PBMC 等珍贵有限样本检测。
（四）国产 WKB-96 与进口设备实验数据一致性对比
取同一批巨噬细胞上清、T 细胞增殖样本，分别使用博清 WKB-96 与进口酶标仪平行检测，CCK-8 OD 值、细胞因子浓度、发光积分三组数据相关性R²均>0.998，两组设备统计学结论完全一致；而 WKB-96 内置恒温孵育模块无需外接培养箱完成显色孵育，单批次实验总时长缩短 30% 以上，采购与运维成本显著低于进口设备，更适配中小型科研实验室、高校免疫学课题组常态化高通量实验需求。
三、讨论
免疫细胞活化研究依赖多表型联合检测，单一检测手段仅能反映细胞活化单一维度，难以完整解析免疫调控通路：细胞增殖仅反映细胞扩增水平，细胞因子分泌表征功能性活化，ROS 发光体现上游天然免疫信号通路激活，三类指标同步定量是标准化实验的刚需。本研究证实博清生物WKB-96酶标仪可一体化实现化学发光、恒温孵育、自动数据分析，完整覆盖免疫细胞活化全套体外检测技术体系，解决传统分设备上机带来的样本损耗、操作误差、实验周期冗长等痛点。
从仪器技术层面分析，WKB-96 搭载线性 PMT 双光路补偿系统，大幅降低微孔板边缘效应、基质背景干扰，针对原代免疫细胞、低浓度细胞上清等难检测样本仍保持超高灵敏度；宽线性吸光区间兼顾高密度增殖细胞高 OD 读数与微量细胞因子低 OD 定量，无需梯度稀释重测，节约珍贵原代细胞样本；内置精准温控模块模拟细胞培养 37℃环境，ELISA 显色、CCK-8 孵育可直接在设备内完成，减少样本转移过程污染风险与温度波动干扰；配套专业免疫学分析软件内置多类曲线拟合模型、批量统计工具，无需导出第三方软件二次处理，降低数据分析门槛，适配高通量药物筛选、多梯度刺激机制研究等大批量样本实验场景。
相较于进口微孔板检测设备，博清生物 WKB-96 作为国产化自主研发仪器，在满足同等检测精度、多模式兼容能力基础上，大幅降低实验室设备采购与后期耗材、维护成本，同时支持本地化技术售后，更贴合国内高校、研究院所、药企免疫药理实验室的使用需求。在应用场景拓展上，除本文巨噬细胞、T 细胞活化基础模型外，该设备还可延伸用于 DC 细胞成熟检测、NK 细胞杀伤活性定量、免疫佐剂活性评价、自身免疫病外周血淋巴细胞功能检测、CAR-T 细胞体外活化筛选等前沿免疫学研究，覆盖固有免疫、适应性免疫、肿瘤免疫、炎症药理多研究方向。
博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96酶标仪具备高精度、多检测模式一体化、自动化高通量、内置恒温孵育等核心优势，在巨噬细胞 LPS 极化、原代 T 细胞共刺激活化两大经典免疫模型中，可稳定、精准完成细胞增殖 CCK-8 比色、细胞因子 ELISA 定量、活化 ROS 化学发光多维度检测，检测重复性、线性范围、灵敏度与进口同类设备数据高度一致，同时显著简化实验流程、降低科研设备使用成本。该设备构建起标准化、国产化免疫细胞活化全流程检测平台，为基础免疫学、肿瘤免疫、炎症机制、免疫药物筛选等生物实验室研究提供可靠精密仪器支撑，具备广泛的科研推广应用价值。
