钙离子、氢离子、钠离子作为细胞核心第二信使，参与几乎全部细胞生理进程：Ca²⁺调控肌细胞收缩、神经元递质释放、肿瘤细胞增殖凋亡；胞内 pH 维持酶活、自噬与溶酶体功能；Na⁺介导细胞膜电位、转运体协同调控通路，离子稳态失衡直接诱发神经退行性疾病、肿瘤、心血管损伤等病理表型。精准捕捉刺激后胞内离子浓度实时动态变化（瞬时峰值、周期性振荡、衰减恢复速率）是阐明细胞信号通路、筛选离子通道靶向药物的核心实验依据。
目前胞内离子定量主流技术分为荧光显微成像与分光荧光计检测两类：共聚焦显微镜侧重单细胞空间分布观测，但批量动力学定量效率低；传统大型进口荧光分光光度计设备昂贵、体积庞大、恒温控制精度不足，批量细胞悬液长时间动态监测易出现信号漂移、基线波动，限制高通量功能筛选实验开展。
博清生物科技（南京）有限公司自主研发台式荧光计，集成双单色器光学系统、恒温控温样品仓、高速动力学采集程序、低噪声光电倍增管检测器，支持微量细胞悬液、微孔板兼容检测，适配 AM 酯化型活细胞荧光探针比率法/单波长定量检测，可连续数百秒无间断采集荧光强度变化曲线。
一、材料与仪器
（一）实验仪器
博清生物荧光计；细胞培养超净台；CO₂恒温细胞培养箱；低速离心机；恒温水浴锅；倒置光学显微镜；紫外灭菌操作台；微量移液器系列。
（二）细胞株与试剂
细胞：人胚肾 HEK293T 细胞、人乳腺癌 MCF-7 细胞、大鼠原代大脑星形胶质细胞；
荧光探针：Fluo-4 AM（Ca²⁺探针）、SNARF-1 AM（pH 比率探针）、SBFI AM（Na⁺探针）、Pluronic F-127 助溶剂；
细胞培养基：高糖 DMEM、胎牛血清 FBS、青链霉素混合液；实验缓冲液 HBSS（无酚红）；刺激试剂：KCl（膜去极化剂）、离子霉素（Ca²⁺阳性对照）、H₂O₂（氧化应激刺激）、EGTA（钙离子螯合剂）；DMSO 探针溶解溶剂；PBS 洗涤缓冲液。
（三）探针储存与工作液配制
所有 AM 探针以无水 DMSO 配制成 5 mmol/L 储备液，-20 ℃避光分装保存；实验工作液以无血清 HBSS 稀释，终浓度 Fluo-4 AM 2 μmol/L、SNARF-1 AM 3 μmol/L、SBFI AM 5 μmol/L，添加 0.02% Pluronic F-127 促进探针跨膜内化，全程避光操作。
二、实验方法
（一）细胞培养与探针负载
1、贴壁细胞消化离心，HBSS 重悬调整细胞密度至 1×10⁶ cells/mL，取 2 mL 细胞悬液加入石英荧光比色皿；
2、加入探针工作液，37 ℃避光孵育 40 min，使 AM 酯探针进入细胞后胞内酯酶水解活化，特异性结合胞内游离离子；
3、无酚红 HBSS 洗涤细胞 3 次，去除胞外未负载游离探针，避免背景荧光干扰；
4、重悬细胞至 2 mL 预热 HBSS，置于博清荧光计恒温样品仓，设置仓温 37 ℃，预平衡 5 min 稳定基线荧光。
（二）博清荧光计动力学检测参数设置
1、胞内 Ca²⁺动态检测（Fluo-4 AM 单波长法）
激发波长 488 nm，发射波长 525 nm；动力学采集模式，采集间隔 0.1 s，总采集时长 300 s；前 30 s 记录基础荧光 F₀，30 s 时点快速加入刺激剂（高钾 KCl/H₂O₂），200 s 加入离子霉素 + EGTA 分别测定最大荧光 Fmax、最小荧光 Fmin，软件自动换算胞内游离 Ca²⁺浓度。
2、胞内 pH 比率检测（SNARF-1 双波长比率法）
激发 480 nm，发射 580 nm、640 nm 双通道同步采集；以 580/640 荧光强度比值计算胞内 pH，配套标准 pH 缓冲液校准曲线校正。
3、胞内 Na⁺检测（SBFI 比率法）
激发 340/380 nm 双波长，发射 510 nm；双激发比值定量胞内钠离子浓度，设备双单色器同步切换，无采集延时误差。
（三）分组实验设计
1、空白对照组：仅加入等体积 HBSS 缓冲液，无刺激；
2、膜去极化组：100 mmol/L KCl 瞬时刺激，诱导钙通道开放、Ca²⁺内流；
3、氧化应激损伤组：200 μmol/L H₂O₂处理，观察胞内钙超载、pH 酸化动态；
4、阳性对照组：离子霉素完全通透细胞膜，获得离子饱和荧光信号；
每组 3 次生物学重复，同步采用进口同类型荧光分光光度计平行检测，对比信噪比、基线漂移、动力学曲线平滑度。
三、实验结果
（一）仪器基础检测性能验证
采用梯度离子标准荧光溶液检测博清生物荧光计线性与信噪比：Ca²⁺浓度 0–1 000 nmol/L 区间荧光强度线性相关系数 R²=0.9994；pH 6.0–7.8 区间比率信号线性稳定；Na⁺ 0–150 mmol/L 检测区间无信号饱和。
同等细胞样品条件下，博清荧光计信噪比 46.2±2.1，进口参比仪器信噪比 41.5±1.8；连续 300 s 动态采集基线漂移幅度＜2.3 RFU，进口设备基线漂移 7.8 RFU，证明设备低噪声光学系统可大幅降低长时间监测信号偏移，适配慢动力学离子振荡检测。
（二）不同刺激下胞内 Ca²⁺动态实时监测结果
以大鼠星形胶质细胞为模型，KCl 去极化刺激后，博清荧光计可清晰捕捉三类典型钙信号特征：快速瞬时钙峰、持续性钙升高、周期性钙振荡。
空白对照组胞内基础 Ca²⁺浓度维持 80–120 nmol/L 稳定基线；KCl 刺激后 2–3 s 内钙浓度快速上升至 680±42 nmol/L 峰值，随后缓慢衰减，半衰期约 62 s；H₂O₂氧化应激组出现不可逆钙超载，刺激 150 s 后胞内 Ca²⁺持续高于 500 nmol/L，细胞后续凋亡表型与钙超载时序完全匹配。
动力学曲线无锯齿状杂波，0.1 s 高速采集完整保留钙信号瞬时波动细节，优于传统设备 0.5 s 采集间隔造成的峰值信号丢失问题。
（三）胞内 pH 与 Na⁺稳态动态检测结果
氧化应激刺激后，MCF-7 肿瘤细胞胞内 pH 由 7.21 快速降至 6.73，博清荧光计双波长同步采集无时间差，比率曲线可精准反映酸化速率；SBFI 钠离子检测结果显示，膜去极化诱导 Na⁺快速内流，50 s 达到稳态浓度 112 mmol/L，设备双单色器自动切换激发波长，无需手动调整参数，批量检测效率显著提升。
（四）多细胞模型通用性对比
HEK293T、星形胶质原代细胞、MCF-7 细胞三种细胞悬液重复检测，博清荧光计均可稳定获得清晰离子动力学曲线，细胞自发荧光背景抑制效果稳定；原代细胞脆弱、荧光信号偏弱样本中，设备高灵敏 PMT 检测器仍可有效区分有效信号与背景，满足原代细胞、原代神经细胞低丰度离子信号检测需求。
四、讨论
胞内离子动态变化是细胞信号传导最直接的量化标志物，传统检测设备的技术短板长期制约国内实验室离子功能学高通量研究。本研究证实博清生物自主研发荧光计依靠优化光学光路、恒温样品仓、高速动力学采集模块，完美适配 Fluo 系列、SNARF、SBFI 等主流活细胞离子荧光探针的比率法、单波长定量检测，可连续数百秒稳定记录刺激诱导下胞内 Ca²⁺、pH、Na⁺浓度动态全过程，完整捕捉瞬时峰值、振荡周期、稳态恢复速率等关键动力学参数。
仪器低基线漂移、高信噪比特性解决了长时间活细胞监测中信号失真难题，尤其适用于氧化应激、药物缓慢作用、离子通道长效激活等慢动力学实验；毫秒级采集间隔可完整记录神经元、心肌细胞毫秒级钙瞬变，弥补荧光显微镜批量定量不足的短板。同时设备国产化大幅降低仪器采购与维护成本，无需依赖进口设备配套耗材，适合高校基础实验室、药企药理筛选平台、临床病理机制研究平台普及使用。
本研究成功建立一套以博清生物台式荧光计为核心的活细胞胞内离子浓度动态实时定量监测实验体系，可精准、稳定检测 Ca²⁺、H⁺、Na⁺三类关键胞内离子的动态波动，设备线性检测范围宽、信噪比高、动力学采集响应快、恒温适配活细胞长时间观测，兼容肿瘤细胞、原代神经细胞、工具细胞等多种细胞模型。相较于传统进口荧光检测设备，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计具备成本优势、操作简便、占地小、数据自动化分析等突出优势，可作为细胞功能研究、离子通道药物筛选、细胞损伤机制探究的标准化国产化定量检测仪器，为国内生命科学实验室胞内离子稳态相关研究提供可靠、经济的全新技术方案。
