遗传病多由基因突变、拷贝数变异（CNV）及基因片段缺失/重复所致，其中基因片段缺失因涉及外显子或关键功能区域，常导致蛋白功能完全丧失，引发严重遗传病，如 SMA、地中海贫血、先天性无虹膜等。当前基因片段缺失检测方法多样：多重连接依赖探针扩增（MLPA）精准但成本高、周期长；二代测序（NGS）通量高但数据分析复杂、设备昂贵；常规 PCR 仅能定性，无法定量检测杂合缺失。
荧光定量 PCR（qPCR）凭借实时荧光监测、定量精准、操作简便、快速经济等优势，成为基因片段缺失检测主流技术，通过检测目标基因与内参基因的拷贝数比值，判断缺失类型（纯合缺失：比值≈0；杂合缺失：比值≈0.5；正常：比值≈1）。博清生物科技（南京）有限公司研发的BOD-16PE是国产便携式荧光定量PCR仪，具备16孔反应模块、多通道荧光检测、精准温控及触控操作等特点，适配基层实验室与现场检测场景。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器设备：博清生物 BOD-16PE 荧光定量 PCR 仪；荧光定量 PCR 仪（对照）；高速离心机；核酸定量仪；PCR 扩增仪。
2、试剂与耗材：SYBR Green I qPCR 预混液；基因组 DNA 提取试剂盒；SMN1、PAX6、TRAPPC2 基因及内参基因（GAPDH）特异性引物；1.5mL 离心管、0.1mL 八联管。
（二）引物设计
针对 SMN1 基因外显子 7、PAX6 基因外显子 5-6、TRAPPC2 基因外显子 4-6 及内参基因 GAPDH 设计特异性引物，扩增片段长度 100-200bp，确保引物特异性与扩增效率。
（三）基因组 DNA 提取
取外周血 2mL，EDTA 抗凝，按 DNA 提取试剂盒说明书操作，提取基因组 DNA；核酸定量仪检测 DNA 浓度与纯度，浓度调整至 50ng/μL，OD260/OD280 比值 1.8-2.0，-20℃保存备用。
（四）qPCR 反应体系与条件
1、20μL 反应体系：SYBR Green I 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各 0.8μL，模板 DNA（50ng/μL）1μL，ddH₂O 7.4μL；同时设置内参基因反应体系与阴性对照（ddH₂O 为模板）。
2、BOD-16PE 仪器反应条件：95℃预变性 10min；95℃变性 15s，60℃退火 30s，72℃延伸 25s，40 个循环；76℃荧光检测 1s；溶解曲线分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s，检测荧光信号变化。
3、对照仪器反应条件：对照仪器采用相同反应体系与温度程序，对比检测结果。
（五）性能评估指标
1、重复性：取 3 例不同基因型样本（纯合缺失、杂合缺失、正常），每样本设置 3 复孔，连续检测 3 批，计算批内与批间变异系数（CV 值）。
2、灵敏度：将正常基因组 DNA 梯度稀释（50ng、20ng、10ng、5ng、1ng），检测最低可检出 DNA 浓度。
3、特异性：检测 30 例正常样本与非目标遗传病样本，评估交叉反应情况。
4、准确性：以 MLPA/Sanger 测序结果为金标准，计算 BOD-16PE 仪器检测结果的一致性。
二、实验结果
（一）BOD-16PE 仪器基础性能
BOD-16PE 仪器搭载 7 寸触控屏，支持无 PC 独立操作；16 孔 0.1mL 反应模块，兼容八联管；温控范围 4-100℃，温控精度 ±0.2℃，孔间均一性 ±0.15℃；激发波长 455-650nm，检测波长 510-750nm，支持 FAM、HEX 等多通道荧光检测，适配 SYBR Green I 与 TaqMan 探针法。仪器体积小，重量轻，便携性强，适合基层实验室与现场检测。
（二）扩增曲线与溶解曲线分析
BOD-16PE 仪器可实时采集荧光信号，扩增曲线平滑，基线平稳，指数扩增期明显，无引物二聚体与非特异性扩增干扰；溶解曲线呈单一特异峰，无杂峰，证实引物特异性良好，扩增产物单一，可准确区分目标基因扩增信号与背景噪音。正常样本目标基因相对拷贝数≈1，杂合缺失样本≈0.5，纯合缺失样本≈0，基因型区分清晰。
（三）重复性实验结果
3 例不同基因型样本批内 CV 值 0.85%-1.52%，批间 CV 值 1.03%-1.89%，均小于 2%，表明 BOD-16PE 仪器检测重复性良好，结果稳定可靠。
（四）灵敏度与特异性实验结果
灵敏度检测显示，最低可检出 10ng 基因组 DNA，荧光信号清晰，Ct 值稳定（32-35）；5ng 及以下 DNA 无有效扩增信号，确定检测灵敏度为 10ng。特异性检测 30 例正常样本与 20 例非目标遗传病样本，均未检出目标基因缺失，特异性 100%，无交叉反应。
（五）样本检测一致性
120 例样本中，BOD-16PE 仪器检出 SMN1 纯合缺失 18 例、杂合缺失 22 例；PAX6 杂合缺失 16 例；TRAPPC2 半合子缺失 11 例、杂合缺失 9 例；正常样本 30 例，结果与 MLPA/Sanger 测序一致 119 例，一致性 99.2%；仅 1 例 PAX6 疑似缺失样本 qPCR 结果为杂合缺失，测序证实为内含子多态性，无功能缺失，假阳性率 0.8%。与对照仪器对比，两者检测结果一致性 98.3%，无显著差异（P>0.05）。
（六）检测效率与成本对比
BOD-16PE 仪器单批次检测 16 样本，全程 2 小时内完成；MLPA 需 1-2 天，NGS 需 3-5 天。成本方面，BOD-16PE qPCR 单样本试剂成本约 20 元，仪器价格为进口仪器 1/3-1/2；MLPA 单样本约 200 元，NGS 单样本约 500 元，BOD-16PE 仪器检测兼具高效与经济优势。
三、讨论
基因片段缺失是遗传病分子诊断的核心靶点，qPCR 技术因精准定量、快速经济成为首选方法，而仪器性能直接决定检测结果可靠性。本研究证实，博清生物 BOD-16PE 荧光定量 PCR 仪凭借精准温控、稳定荧光检测、良好重复性与高灵敏度，可准确检测 SMA、先天性无虹膜、X 连锁迟发性脊椎骨骺发育不良等遗传病相关基因片段缺失，区分纯合缺失、杂合缺失与正常基因型，一致性达 99.2%，与进口高端 qPCR 仪无显著差异。
BOD-16PE 仪器核心优势在于便携性与基层适配性：体积小、重量轻，支持触控独立操作，无需配套电脑，适合基层机构、妇幼保健院及现场筛查场景；16 孔通量适配中小型样本检测，避免高端仪器 96 孔通量的资源浪费；多通道荧光检测兼容 SYBR Green I 与 TaqMan 探针法，可灵活适配不同检测需求。性能上，温控精度 ±0.2℃、重复性 CV<2%、灵敏度 10ng，满足分子诊断的严格要求，有效避免常规 PCR 定性不准、假阳性率高的问题。
应用中，SMA 是常见常染色体隐性遗传病，95% 以上患者由 SMN1 基因外显子 7 纯合缺失导致，qPCR 可快速筛查携带者与患者，为新生儿筛查与产前诊断提供支持；先天性无虹膜多由 PAX6 基因片段缺失或突变所致，qPCR 可精准检测外显子缺失，辅助确诊；X 连锁迟发性脊椎骨骺发育不良由 TRAPPC2 基因外显子缺失导致，qPCR 可区分男性半合子缺失与女性杂合缺失，指导遗传咨询。本研究中，BOD-16PE 仪器对上述疾病的检测结果与金标准高度一致，验证了其实用性。
对比进口 qPCR 仪，BOD-16PE 仪器价格更低、维护成本少，试剂适配性强，可显著降低基层实验室设备投入与检测成本，解决进口仪器价格昂贵、维修周期长的痛点。同时，其检测效率 2 小时内完成，远快于 MLPA 与 NGS，适合快速诊断与急诊样本检测。但本研究样本量有限，后续需扩大样本类型与数量，涵盖更多遗传病（如地中海贫血、DMD 等），进一步验证仪器通用性；同时优化多重 qPCR 检测体系，实现多基因缺失同步检测，提升检测通量。
博清生物科技（南京）有限公司研发的BOD-16PE荧光定量PCR仪性能稳定、精准可靠，在遗传病基因片段缺失检测中具备高灵敏度、高特异性、良好重复性与一致性，可准确区分不同缺失基因型。仪器便携经济、操作简便、检测快速，适配基层医疗机构与现场筛查需求，有效填补国产便携式 qPCR 仪在遗传病分子诊断领域的应用空白，为遗传病的早期诊断、产前筛查与遗传咨询提供优质、经济的技术解决方案，具有重要的推广价值与应用前景。
