氧化应激是指机体或细胞内活性氧（ROS）的产生与抗氧化防御系统失衡，导致 ROS 过量蓄积，进而攻击生物大分子（DNA、蛋白质、脂质），引发细胞凋亡、组织损伤的病理过程。目前，氧化应激已被证实与神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、肿瘤及衰老等多种疾病密切相关，构建精准、稳定的体外氧化应激模型是解析疾病机制、研发靶向药物的基础。
体外氧化应激模型主要通过化学诱导剂（H₂O₂、叔丁基过氧化氢）、物理干预（缺氧/复氧、紫外照射）或生物因子刺激构建，其中 H₂O₂因稳定性强、诱导效果可控，成为最常用的造模试剂。模型构建后，需同步检测细胞活力、ROS 水平、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量等指标，评估模型有效性及干预物保护效果。
酶标仪作为集吸光度、荧光、化学发光检测于一体的多功能设备，可实现 96 孔板高通量、快速检测，是氧化应激模型指标验证的核心仪器。博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96微孔板读数仪采用创新线性 PMT 检测技术与双激发光源补偿技术，支持吸光度、荧光、化学发光多模式检测，具备室温 - 45℃精准温控、自动进出仓及开机自检校准功能，为氧化应激模型构建提供了高效、精准的技术平台。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、细胞株
人肾小管上皮细胞 HK-2。
2、主要试剂
DMEM/F12 培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素 - 链霉素双抗；H₂O₂；CCK-8 细胞活力检测试剂盒、ROS 检测试剂盒（DCFH-DA 探针）、SOD 活性检测试剂盒、MDA 检测试剂盒、LDH 释放检测试剂盒；PBS 缓冲液。
3、主要仪器
博清生物 WKB-96 微孔板读数仪；CO₂细胞培养箱；超净工作台；高速冷冻离心机；倒置荧光显微镜。
（二）实验方法
1、细胞培养
HK-2 细胞用含 10% FBS、1% 青霉素 - 链霉素双抗的 DMEM/F12 培养基，置于 37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞融合至 80%-90% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。
2、H₂O₂诱导 HK-2 细胞氧化应激模型构建
将HK-2细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，每孔培养基体积 100μL，置于培养箱中培养24h，待细胞完全贴壁后，弃去原培养基，分为空白对照组（正常培养，不加H₂O₂）、模型组（加入含不同浓度 H₂O₂的培养基，终浓度分别为50、100、200、400μmol/L），每组设置6个复孔，置于培养箱中继续培养 24h。
3、博清生物 WKB-96 酶标仪检测核心指标
细胞活力检测（CCK-8 法）
造模结束后，弃去各孔培养基，每孔加入 100μL 新鲜培养基与 10μL CCK-8 试剂，轻轻振荡混匀，置于 37℃培养箱中避光孵育 2h。将 96 孔板放入博清生物 WKB-96 酶标仪，设置检测波长 450nm，采用终点法检测各孔吸光度（OD）值，细胞活力计算公式：细胞活力（%）=（模型组 OD 值/空白对照组 OD 值）×100%。
ROS 水平检测（DCFH-DA 荧光法）
弃去各孔培养基，用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 次，每孔加入 100μL 含 DCFH-DA 探针（终浓度 10μmol/L）的无血清培养基，37℃避光孵育 30min。孵育结束后，弃去探针溶液，PBS 洗涤 2 次，加入 100μL 新鲜培养基，将 96 孔板放入博清生物 WKB-96 酶标仪，设置激发波长 502nm、发射波长 523nm，检测各孔荧光强度（FI），ROS 相对含量以荧光强度值表示。
SOD 活性检测
采用黄嘌呤氧化酶法检测 SOD 活性，严格按照 SOD 检测试剂盒说明书操作：造模结束后，弃去培养基，PBS 洗涤细胞 2 次，每孔加入 100μL 细胞裂解液，冰上裂解 30min，4℃、12000r/min 离心 10min，取上清液作为待测样品。在 96 孔板中依次加入待测样品、试剂 A、试剂 B，混匀后置于 37℃孵育 30min，放入博清生物 WKB-96 酶标仪，设置波长 550nm，检测各孔 OD 值，计算 SOD 活性（U/mg 蛋白）。
MDA 含量检测
采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测 MDA 含量，取上述细胞裂解上清液，按照 MDA 检测试剂盒说明书操作：在 96 孔板中加入待测样品、TBA 试剂，混匀后沸水浴 40min，冷却至室温，4℃、3000r/min 离心 10min，取上清液放入博清生物 WKB-96 酶标仪，设置波长 532nm，检测各孔 OD 值，计算 MDA 含量（nmol/mg 蛋白）。
LDH 释放量检测
造模结束后，取各孔细胞培养上清液，按照 LDH 检测试剂盒说明书操作，在 96 孔板中加入上清液、底物试剂、辅酶试剂，37℃孵育 15min，加入终止液，放入博清生物 WKB-96 酶标仪，设置波长 450nm，检测各孔 OD 值，计算 LDH 释放量（U/L）。
4、仪器性能验证
重复性验证
取同一批次 H₂O₂（200μmol/L）诱导的 HK-2 细胞，采用博清生物 WKB-96 酶标仪连续检测 6 次 ROS 水平、SOD 活性及 MDA 含量，计算各指标检测结果的变异系数（CV），CV＜5% 为重复性良好。
灵敏度验证
配制梯度浓度的 SOD 标准品（10、20、50、100、200U/mL）与 MDA 标准品（1、2、5、10、20nmol/mL），采用博清生物 WKB-96 酶标仪检测，绘制标准曲线，计算最低检测限（LOD），评估仪器灵敏度。
二、结果
（一）不同浓度 H₂O₂对 HK-2 细胞活力的影响
CCK-8 检测结果显示，与空白对照组相比，不同浓度 H₂O₂处理后，HK-2 细胞活力显著下降，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。其中 50μmol/L H₂O₂处理组细胞活力为（82.36±3.15）%，100μmol/L 组为（65.72±2.89）%，200μmol/L 组为（48.15±2.03）%，400μmol/L 组为（32.47±1.56）%。后续实验选取 200μmol/L H₂O₂作为造模浓度，此时细胞活力约 50%，可稳定构建氧化应激损伤模型。
（二）博清生物 WKB-96 酶标仪检测氧化应激指标结果
1、ROS 水平变化
荧光检测结果显示，空白对照组 ROS 荧光强度为（102.35±8.62），200μmol/L H₂O₂模型组荧光强度显著升高至（389.62±15.37），差异具有统计学意义（P＜0.01），表明模型组细胞内 ROS 大量蓄积，氧化应激模型构建成功。
2、抗氧化酶活性变化
SOD 活性检测结果显示，空白对照组 SOD 活性为（125.36±6.89）U/mg 蛋白，模型组 SOD 活性显著降低至（58.72±3.15）U/mg 蛋白（P＜0.01），表明氧化应激状态下细胞抗氧化酶系统受损。
3、脂质过氧化产物变化
MDA 含量检测结果显示，空白对照组 MDA 含量为（2.15±0.32）nmol/mg 蛋白，模型组 MDA 含量显著升高至（8.62±0.75）nmol/mg 蛋白（P＜0.01），表明 ROS 过量蓄积引发脂质过氧化损伤。
4、细胞损伤标志物变化
LDH 释放量检测结果显示，空白对照组 LDH 释放量为（45.36±3.21）U/L，模型组 LDH 释放量显著升高至（156.72±8.65）U/L（P＜0.01），表明氧化应激导致细胞膜损伤，细胞内容物泄漏。
（三）博清生物 WKB-96 酶标仪性能评价
1、重复性
同一批次样品重复检测 6 次，ROS 水平、SOD 活性、MDA 含量的变异系数分别为 2.15%、2.89%、2.56%，均＜3%，表明仪器检测重复性良好，数据稳定可靠。
2、灵敏度
SOD 标准曲线回归方程为 y=0.0023x+0.012，R²=0.9992，最低检测限为 5U/mL；MDA 标准曲线回归方程为 y=0.0315x+0.028，R²=0.9995，最低检测限为 0.5nmol/mL，表明仪器灵敏度高，可精准检测微量生物分子含量。
三、讨论
氧化应激模型的稳定性与指标检测的精准度是决定科研结果可靠性的关键。本研究采用 H₂O₂诱导 HK-2 细胞构建氧化应激模型，通过博清生物 WKB-96 酶标仪同步检测细胞活力、ROS 水平、抗氧化酶活性及脂质过氧化产物等核心指标，系统验证了仪器在氧化应激模型构建中的应用价值。
H₂O₂作为强氧化剂，可透过细胞膜进入细胞，分解产生羟基自由基等活性氧，引发氧化应激损伤。本研究结果显示，200μmol/L H₂O₂处理 HK-2 细胞 24h 后，细胞活力降至约 50%，ROS 荧光强度升高至空白对照组的 3.8 倍，SOD 活性显著降低，MDA 含量与 LDH 释放量显著升高，与文献报道一致，表明该造模条件可稳定构建氧化应激损伤模型，为后续干预实验提供可靠模型基础。
博清生物 WKB-96 酶标仪的技术优势是保障检测精准度的核心。其一，仪器采用线性 PMT 检测技术，相较于传统光电二极管，灵敏度提升显著，最低检测限可达 100pg/ml，可精准捕捉氧化应激模型中微量 ROS、抗氧化酶及脂质过氧化产物的变化，避免低丰度指标漏检；其二，双激发光源补偿技术可有效减少环境光干扰与荧光信号衰减，保证荧光检测的稳定性，本研究中 ROS 荧光检测重复性 CV＜2.2%，数据可靠性高；其三，室温 - 45℃精准温控系统，可匹配细胞孵育温度，避免温度波动影响酶促反应活性，保障 SOD、LDH 等酶活性检测的准确性；其四，96 孔板高通量检测模式，单次可完成 96 个样品检测，相较于单管检测，效率提升 8 倍以上，大幅缩短实验周期，适合大规模样本筛选实验。
重复性与灵敏度是评价酶标仪性能的核心指标。本研究结果显示，博清生物 WKB-96 酶标仪对 ROS、SOD、MDA 指标的检测重复性 CV 均＜3%，优于行业标准（CV＜5%），表明仪器检测稳定性强，可有效减少实验误差，保证组间数据可比性；同时，仪器对 SOD、MDA 标准品的最低检测限分别为 5U/mL、0.5nmol/mL，灵敏度高，可满足氧化应激模型中低丰度指标的检测需求，避免因灵敏度不足导致的假阴性结果。
此外，博清生物 WKB-96 酶标仪支持吸光度、荧光、化学发光多模式检测，可覆盖氧化应激模型中细胞活力（吸光度）、ROS 水平（荧光）、ATP 含量（化学发光）等多维度指标检测，无需更换仪器即可完成全套指标验证，简化实验流程，降低设备成本。同时，仪器配备流程式管理软件，支持自动布板、数据实时分析、结果自动导出，操作简便，无需专业技术人员即可快速上手，适合不同科研场景使用。
博清生物科技（南京）有限公司研发的 WKB-96 微孔板读数仪凭借高灵敏度、宽动态范围、精准温控、高通量检测及多模式兼容等技术优势，可高效适配 H₂O₂诱导的细胞氧化应激模型构建，精准检测细胞活力、ROS 水平、抗氧化酶活性及脂质过氧化产物等核心指标，检测重复性＜3%，灵敏度可达 100pg/ml，数据稳定可靠。该仪器操作简便、功能全面，可大幅提升氧化应激相关科研的实验效率与数据精准度，为氧化应激机制探究、抗氧化药物筛选及疾病防治研究提供重要的技术支撑，具有广泛的科研应用前景。
