细胞凋亡是由基因调控的细胞程序性死亡过程，化疗药物通过激活肿瘤细胞内源性或外源性凋亡通路、破坏 DNA 结构与功能、抑制细胞分裂等机制，诱导癌细胞凋亡，是临床肿瘤化疗的核心药理基础。传统凋亡检测方法（如流式细胞术、TUNEL 染色）存在操作繁琐、通量低、成本高等局限，而酶标仪凭借96孔板高通量检测、多信号模式兼容及自动化数据处理优势，已成为肿瘤药理学研究的主流设备。
博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96 微孔板读数仪（酶标仪）集成线性 PMT 检测、双激发光源补偿、共聚焦光路三大核心技术，支持吸光度、时间分辨荧光、化学发光多模式检测，温控范围室温至 45℃，具备自动校准、动态范围调整及高通量数据处理功能。本研究聚焦其在化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡研究中的应用，系统验证其在细胞活力、凋亡蛋白酶活性、细胞膜磷脂外翻等关键指标检测中的性能，为肿瘤药物研发提供标准化检测方案。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、细胞株：人肺癌细胞 A549。
2、主要试剂：顺铂、CCK-8 试剂盒、Caspase-3 荧光检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒、RPMI 1640 培养基、胎牛血清。
3、仪器设备：博清生物 WKB-96 酶标仪、CO₂培养箱、倒置显微镜、超净工作台。
（二）细胞培养
A549 细胞培养于含 10% FBS、100U/mL 青霉素 + 100μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 培养基，置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养，每 2-3 天传代 1 次，取对数生长期细胞用于实验。
（三）实验方法
1、CCK-8 法检测细胞增殖抑制率
细胞接种：对数期 A549 细胞消化制备单细胞悬液，以 2×10³ 个 / 孔接种于 96 孔板，每孔 200μL，培养 24h 待细胞贴壁。
药物处理：设置空白对照组（无细胞）、阴性对照组（0.1% DMSO）、DDP 处理组（浓度梯度：2、4、8、16、32μg/mL），每组设 6 复孔，药物作用 48h。
显色检测：每孔加入 20μL CCK-8 试剂，37℃避光孵育 2h，博清 WKB-96 酶标仪 450nm 波长检测吸光度（OD₄₅₀），计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1 - 实验组 OD₄₅₀/ 对照组 OD₄₅₀）×100%
2、Caspase-3 活性检测
细胞处理：同 1.2.1，DDP（8μg/mL）作用 24h、48h，收集细胞。
试剂孵育：按试剂盒说明书制备细胞裂解液，加入 Ac-DEVD-AMC 荧光底物，37℃避光孵育 2h。
荧光检测：WKB-96 酶标仪激发波长 380nm、发射波长 460nm检测相对荧光单位（RFU），以 RFU 值反映 Caspase-3 活性。
3、Annexin V-FITC/PI 双染荧光定量检测
细胞处理：DDP（8μg/mL）作用 48h，胰酶消化（无 EDTA）收集细胞，PBS 洗涤 2 次。
染色操作：按试剂盒说明书加入 5μL Annexin V-FITC 和 10μL PI，室温避光孵育 15min。
酶标仪检测：96 孔黑色板中，WKB-96 酶标仪FITC 通道（Ex 488nm/Em 525nm）、PI 通道（Ex 535nm/Em 615nm） 检测荧光强度，计算早期凋亡率（Annexin V⁺/PI⁻）。
二、结果
（一）顺铂对 A549 细胞增殖的抑制作用
CCK-8 结果显示，顺铂对 A549 细胞增殖具有浓度依赖性抑制效应：2μg/mL 时抑制率为（18.52±2.13）%，32μg/mL 时达（76.35±3.47）%，IC₅₀约为 7.8μg/mL。博清 WKB-96 酶标仪检测数据重复性好，组内 CV 值均 < 3%，符合高通量检测标准。
（二）顺铂诱导 A549 细胞 Caspase-3 激活
Caspase-3 是凋亡执行核心蛋白酶，其活性升高是凋亡发生的关键标志。结果显示，对照组 Caspase-3 活性 RFU 为（125.63±10.24），顺铂作用 24h 升至（486.72±25.36），48h 达（892.51±36.82），显著高于对照组（P<0.01），证实顺铂通过激活 Caspase-3 通路诱导凋亡。
（三）Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡率
博清 WKB-96 酶标仪双荧光通道同步检测结果显示，对照组早期凋亡率仅（3.25±0.86）%，顺铂（8μg/mL）作用 48h 后，早期凋亡率升至（42.68±3.15）%，晚期凋亡 + 坏死率为（18.32±2.47）%，与流式细胞术检测结果一致性达 95% 以上，验证酶标仪荧光检测的准确性。
（四）WKB-96 酶标仪核心性能优势
1、高灵敏度：PMT 检测限达 100pg/mL，可精准识别低丰度凋亡信号；
2、多模式兼容：同时支持吸光度（CCK-8）、荧光（Caspase-3、Annexin V）检测，满足多指标需求；
3、精准温控：37℃恒温孵育，保证酶促、染色反应稳定性；
4、高通量高效：96 孔板单次检测 < 10s，自动数据导出，适配大规模药物筛选。
三、讨论
化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的研究需兼顾检测灵敏度、通量、准确性，博清 WKB-96 酶标仪完美契合这一需求。本研究通过三大经典实验证实：
（一）CCK-8 法：依托酶标仪 450nm 吸光度精准检测，快速筛选化疗药物 IC₅₀，明确量效关系，为药物浓度选择提供依据；
（二）Caspase-3 活性检测：利用荧光检测模式，定量分析凋亡核心蛋白酶激活，揭示药物作用分子机制；
（三）Annexin V-FITC/PI 双染：双荧光通道同步读取，区分凋亡早晚期，弥补传统显微镜观察的主观性缺陷。
相较于传统检测手段，WKB-96 酶标仪优势显著：无需细胞固定、操作步骤简化、样本用量少、可实现高通量平行检测，尤其适用于多种化疗药物、多浓度梯度、多时间点的大规模筛选。同时，仪器配套流程式管理软件，可自动拟合曲线、计算抑制率与凋亡率，减少人为误差，提升实验数据可靠性。
博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96酶标仪凭借高灵敏度检测、多信号模式兼容、精准温控、高通量自动化等核心优势，可高效、精准完成化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡研究中的细胞活力、凋亡蛋白酶活性、细胞膜磷脂外翻等关键指标检测。其检测数据稳定、重复性好、操作便捷，为肿瘤化疗药物筛选、药效评价及凋亡机制研究提供了强有力的技术平台，是生物科研实验室肿瘤药理学研究的理想设备。
