MRD是肿瘤复发的“分子源头”，基于ctDNA的MRD检测可突破传统检测局限，实现“分子层面”的早期预警。研究证实，ctDNA-MRD检测灵敏度可达0.001%-0.02%，能在1万条正常DNA中精准识别2条肿瘤源性DNA，较影像学提前6-9个月捕捉复发信号，且可动态反映肿瘤负荷变化，为预后评估、治疗方案调整提供关键依据。目前，ctDNA-MRD检测已被CSCO、NCCN等国内外权威指南纳入实体瘤术后复发监测的核心推荐技术。
实时荧光定量PCR（qPCR）融合PCR扩增与荧光实时检测技术，通过Ct值与初始模板量的线性关系实现核酸精准定量，具备高灵敏度、高特异性、快速高效、操作简便等优势，是分子诊断的主流技术。博清生物科技（南京）有限公司作为国产科研仪器领军企业，其BOD-16PE（16孔）、BOD-96PE（96孔）荧光定量PCR仪，搭载自主研发的实时动态精准温控技术与多通道光学检测系统，适配TaqMan探针法与SYBR Green染料法，可满足科研场景下ctDNA-MRD的高通量、高精准检测需求，为肿瘤复发早期预警提供国产化、高性能技术支撑。
一、材料与方法
（一）研究对象
选取2023年1月-2025年6月于肿瘤中心接受根治性治疗的实体瘤患者320例，其中肺癌102例、结直肠癌98例、乳腺癌85例、胃癌35例；纳入标准：术后病理确诊为Ⅰ-Ⅲ期实体瘤，完成根治性手术/同步放化疗，评估为完全缓解（CR）；排除标准：合并其他恶性肿瘤、严重肝肾功能不全、血液系统疾病。同时纳入100例健康志愿者作为阴性对照。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。
（二）主要仪器与试剂
1、核心仪器：博清生物BOD-96PE荧光定量PCR仪；博清生物核酸提取仪；高速冷冻离心机。
2、主要试剂：血浆游离DNA提取试剂盒；TaqMan探针法qPCR预混液；肿瘤驱动基因（EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA等）特异性引物与探针；内参基因（ACTB）引物与探针；标准品质粒（含已知拷贝数的肿瘤突变基因片段）。
（三）实验方法
1、样本采集与处理
患者于根治性治疗后1个月首次采血，前2年每3个月采血1次，2年后每6个月采血1次；健康志愿者采集外周血1次。每次采集外周静脉血10mL，EDTA抗凝，4℃下1600g离心10min分离血浆，再于4℃下16000g离心10min去除细胞碎片，-80℃保存备用。
2、ctDNA提取与定量
采用博清生物核酸提取仪，严格按照试剂盒说明书提取血浆游离ctDNA，用分光光度计检测浓度与纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间，合格样本用于后续qPCR检测。
3、博清荧光定量PCR检测体系构建
采用TaqMan探针法，针对不同肿瘤类型的驱动基因突变位点设计特异性引物与探针（如肺癌EGFR 19del/L858R、结直肠癌KRAS G12D/G12V、乳腺癌HER2扩增），内参基因ACTB用于校正样本差异。反应体系（20μL）：qPCR预混液10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL，ctDNA模板2μL，无酶水补足至20μL。
反应条件（博清BOD-96PE仪设置）：预变性95℃ 5min；40个循环（95℃ 15s，60℃ 30s，采集荧光信号）；熔解曲线分析（95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s）。以标准品质粒绘制标准曲线，通过Ct值计算样本中ctDNA突变拷贝数，设定突变丰度≥0.01%为MRD阳性。
4、随访与复发判定
所有患者随访至2025年12月，中位随访时间24个月。复发判定依据影像学（CT/MRI/PET-CT）、病理活检及症状，记录复发时间、部位及生存情况。
二、结果
（一）博清荧光定量PCR仪的检测性能验证
以梯度稀释的标准品质粒（突变丰度0.001%-10%）为模板，验证博清BOD-96PE仪的检测性能。结果显示：该平台检测下限（LOD）为0.01% 突变丰度，线性范围0.01%-10%（R²=0.998），扩增效率95%-105%，批内变异系数（CV）<3%，批间CV<5%，符合分子检测的精准性与稳定性要求。健康志愿者样本均为MRD阴性，无假阳性结果，特异性达100%。
（二）患者MRD检测结果与复发情况
320例实体瘤患者中，共检测出MRD阳性患者86例（26.88%），其中肺癌32例（31.37%）、结直肠癌28例（28.57%）、乳腺癌18例（21.18%）、胃癌8例（22.86%）。随访期间，MRD阳性患者中77例（89.53%）出现复发，MRD阴性患者中29例（12.40%）出现复发，差异具有统计学意义（χ²=182.34，P<0.001）。
（三）MRD状态与无复发生存期的相关性
Kaplan-Meier生存分析显示：MRD阳性患者的中位无复发生存期（mRFS）为12个月，显著短于MRD阴性患者的36个月（Log-rank χ²=168.72，P<0.001）。Cox多因素回归分析证实，MRD阳性是肿瘤复发的独立危险因素（HR=8.72，95% CI：5.64-13.48，P<0.001），提示MRD状态可精准预测患者复发风险。
（四）复发预警时间对比
对比MRD检测与影像学检测的复发预警时间：86例MRD阳性复发患者中，79例（91.86%）的MRD阳性结果早于影像学确诊复发，提前时间为6-9个月（中位提前7.5个月）；仅7例（8.14%）患者MRD检测与影像学检测同时阳性。证实博清荧光定量PCR仪可实现肿瘤复发的超早期预警，为干预预留充足时间窗口。
（五）不同肿瘤类型的MRD检测效能
博清荧光定量PCR仪在不同实体瘤中的MRD检测灵敏度为85.71%-92.86%，特异性为92.31%-97.62%，总体准确率为90.63%-96.08%，显示该平台在多癌种复发预警中具有广泛适用性。
三、讨论
（一）博清荧光定量PCR仪在MRD检测中的核心优势
本研究证实，博清生物BOD-16PE/96PE荧光定量PCR仪在肿瘤MRD检测中展现出卓越性能：①超高灵敏度：可检测低至0.01%的ctDNA突变丰度，突破传统检测技术的灵敏度瓶颈，实现极微量残留病灶的精准捕捉；②快速高效：单批次96样本检测仅需2小时，配合仪器独立触控操作，无需外接PC，大幅提升检测效率；③多通道适配：6色荧光通道支持多基因、多突变位点同步检测，适配肺癌、结直肠癌等多癌种驱动基因panel，满足个体化检测需求；④国产自主可控：依托博清生物自主研发的温控与光学技术，仪器稳定性强、成本可控，解决进口仪器依赖问题，推动肿瘤分子检测国产化落地。
（二）MRD检测在肿瘤复发预警中的价值
MRD作为肿瘤复发的“分子预警信号”，其动态监测价值已被本研究充分验证：①超早期预警：较传统影像学提前6-9个月发现复发，为患者争取早期干预机会，显著改善预后；②精准风险分层：MRD阳性患者复发风险是阴性患者的8.72倍，可指导制定差异化随访与治疗策略（如MRD阳性患者强化随访、启动辅助治疗，MRD阴性患者减少过度治疗）；③疗效实时评估：治疗过程中动态监测MRD变化，可快速判断治疗方案有效性，及时调整策略，避免无效治疗。
博清生物科技（南京）有限公司研发的BOD-16PE/96PE荧光定量PCR仪凭借高灵敏度、高特异性、快速高效的技术优势，可精准实现肿瘤术后ctDNA-MRD的动态定量检测，较传统影像学提前6-9个月预警复发，是肿瘤复发早期预警的可靠工具。该平台的应用将显著提升肿瘤精准诊疗水平，改善患者预后，为肿瘤全程管理提供关键技术支撑，具有重要的推广价值与科研应用前景。
