蛋白酶在生命活动中扮演核心角色，其活性调控异常与多种疾病发生发展紧密关联。传统蛋白酶活性检测方法如比色法、放射性同位素法等，存在灵敏度低、操作复杂或安全性差等局限。荧光分析法因灵敏度高、特异性强、可实时监测等优点，成为蛋白酶活性检测的主流技术。
博清生物科技（南京）有限公司作为专注于精密检测仪器研发的企业，其研发的荧光计具备高灵敏度、宽动态范围和高线性度等特性，适用于微量荧光信号的精准检测。
一、材料与方法
（一）仪器与试剂
1、仪器：博清生物荧光计；高速离心机；恒温水浴锅；移液器；96孔黑色微孔板。
2、试剂：FITC-酪蛋白（蛋白酶底物）；胰蛋白酶（标准蛋白酶）；Tris-HCl缓冲液（pH7.4，0.05mol/L）；三氯乙酸（TCA，终止剂）；其他化学试剂均为分析纯。
（二）实验原理
FITC-酪蛋白中异硫氰酸荧光素（FITC）因与酪蛋白结合发生荧光淬灭，荧光强度较低。当蛋白酶催化水解FITC-酪蛋白时，产生的小分子肽段使FITC游离，荧光淬灭效应消除，荧光强度显著增强。通过博清生物荧光计检测反应体系荧光强度变化（ΔRFU），可定量计算蛋白酶活性。
（三）标准曲线建立
1、配制胰蛋白酶标准溶液（0.5、1、2、5、10μg/mL），置于冰浴备用。
2、96孔黑色微孔板中每孔加入50μL Tris-HCl缓冲液（空白对照）或不同浓度胰蛋白酶溶液（样本孔），再加入50μL 0.2mg/mL FITC-酪蛋白底物溶液，轻轻混匀。
3、37℃避光孵育30min，加入100μL 0.6mol/L TCA终止反应。
4、室温静置10min后，10000r/min离心10min，取上清液。
5、博清生物荧光计设定激发波长480nm、发射波长530nm，检测各孔荧光强度（RFU）。
6、以胰蛋白酶浓度为横坐标，ΔRFU（样本RFU-空白RFU）为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程。
（四）精密度与回收率实验
1、精密度：选取低、中、高3个浓度（1、3、8μg/mL）的胰蛋白酶溶液，重复检测6次，计算批内变异系数（CV）。
2、回收率：在已知蛋白酶活性的血清样本中加入不同量胰蛋白酶标准品，按2.3方法检测，计算回收率。
（五）实际样本检测
收集10例健康血清样本，经10000r/min离心10min去除杂质。取20μL血清样本，稀释后检测荧光强度，根据标准曲线计算血清中蛋白酶活性。
二、结果与分析
（一）标准曲线与线性范围
胰蛋白酶浓度在0.5-10μg/mL 范围内，ΔRFU与浓度呈良好线性关系，线性回归方程为y=125.6x+18.3（R²=0.998），表明该方法在检测范围内线性可靠。以3倍空白标准偏差计算，检出限为0.2μg/mL，灵敏度优于传统比色法。
（二）精密度与准确度
3个浓度胰蛋白酶的批内CV分别为2.1%、1.8%、2.5%，均<5%，表明方法精密度良好。回收率实验中，添加浓度为1、3、8μg/mL时，回收率分别为96.2%、98.5%、102.3%，平均回收率98.9%，说明方法准确度高。
（三）实际样本检测
10例健康血清样本蛋白酶活性检测结果为1.2-3.5μg/mL，均值2.1μg/mL，个体间存在一定差异，符合生理特征。检测过程中无明显交叉污染，重复性良好。
（四）博清生物荧光计性能优势
博清生物荧光计采用精密光学系统与线性 PMT 检测技术，可有效消除荧光干扰，实现微量样本（1-20μL）的精准检测。其多通道检测能力支持批量样本并行分析，检测效率较传统单通道仪器提升3倍以上。仪器内置专业软件，可实现数据实时采集、分析与存储，操作便捷，适配实验室常规检测需求。
三、讨论
本研究构建的博清生物荧光计-蛋白酶活性分析体系，结合 FITC-酪蛋白底物的荧光淬灭-恢复原理，实现了蛋白酶活性的快速、精准检测。与传统检测方法相比，该体系具有以下优势：
（一）高灵敏度：检出限达0.2μg/mL，可检测微量蛋白酶活性，适用于低丰度样本分析。
（二）特异性强：FITC-酪蛋白为通用蛋白酶底物，可适配多种蛋白酶检测，且酶解产物的荧光变化特异性高。
（三）操作简便：无需复杂前处理，缩短检测周期。
（四）仪器适配性广：博清生物荧光计体积小巧、维护成本低，适用于常规实验室及检测机构。
在实际应用中，该体系可用于生物样本中蛋白酶活性的常规筛查、疾病相关蛋白酶活性变化研究，以及蛋白酶抑制剂的高通量筛选。同时，通过优化底物类型、检测波长等参数，可进一步拓展对不同类型蛋白酶（如半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶）的检测范围。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计凭借其高灵敏度、高稳定性及便捷操作特性，结合FITC-酪蛋白荧光底物，构建的蛋白酶活性分析方法具有线性范围宽、精密度高、准确度好等优点，适用于生物医学研究、药物研发等领域中蛋白酶活性的定量检测。该方法为蛋白酶相关研究及科研提供了可靠的技术支撑，具有良好的应用前景。
