博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪（微孔板读数仪），采用创新的线性PMT检测技术和双激发光源补偿技术，具备高灵敏度、宽动态范围和高线性度的特点，可支持荧光、比色、发光等多种检测模式，适配多种激酶磷酸化检测方法，广泛应用于生物科研与实验室检测领域。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器 博清生物酶标仪；酶标仪（对照仪器）；高速冷冻离心机；超净工作台；恒温水浴箱；移液器（10μL、100μL、1000μL）。
2、试剂与耗材 重组人AKT1激酶（纯度≥95%）；AKT特异性底物肽（生物素标记）；磷酸化AKT底物特异性抗体（铕穴状化合物Eu³⁺-cryptate标记）；链霉亲和素-XL665（SA-XL665）；ATP（纯度≥99%）；AKT抑制剂渥曼青霉素；TR-FRET激酶活性检测试剂盒；ELISA磷酸化检测试剂盒；胎牛血清；DMEM培养基； Jurkat细胞系；96孔黑色酶标板（荧光检测专用）；96孔透明酶标板（比色检测专用）；无菌离心管、移液枪头（无酶、无RNA酶）。
（二）实验方法
1、基于TR-FRET技术的体外激酶磷酸化活性检测（博清生物酶标仪）
参照TR-FRET激酶活性检测试剂盒说明书，结合博清生物酶标仪的性能参数，建立检测体系。取96孔黑色酶标板，每孔加入20μL AKT激酶缓冲液，随后依次加入10μL不同浓度的重组AKT1激酶（0、0.1、0.5、1、5、10U/mL）、10μL ATP溶液（终浓度10μmol/L）、10μL生物素标记的AKT底物肽（终浓度5μmol/L），轻轻震荡混匀，37℃孵育60min，启动激酶磷酸化反应。反应结束后，每孔加入20μL Eu³⁺-cryptate标记的磷酸化特异性抗体，再加入20μL SA-XL665溶液，震荡混匀，室温避光孵育30min。设置3个复孔，同时设置空白对照组（不加激酶）和阴性对照组（不加底物）。
使用博清生物酶标仪进行信号检测，设置激发波长320nm，检测发射波长620nm（供体信号）和665nm（受体信号），读取每孔的荧光强度值（RLU），计算665nm与620nm荧光强度的比值（R值），以R值反映激酶磷酸化活性水平。同时，使用对照酶标仪进行平行检测，作为对照。
2、基于ELISA技术的细胞内激酶磷酸化活性检测（博清生物酶标仪）
将Jurkat细胞接种于6孔板，每孔接种1×10⁶个细胞，加入DMEM培养基（含10%胎牛血清），37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。随后，加入不同浓度的渥曼青霉素（0、0.1、1、10、100nmol/L），继续培养2h，诱导激酶活性抑制。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入细胞裂解液，冰浴30min，12000r/min、4℃离心15min，收集上清液（细胞总蛋白），采用BCA法测定蛋白浓度，调整所有样品蛋白浓度至一致。
参照ELISA磷酸化检测试剂盒说明书，将细胞总蛋白加入96孔透明酶标板，每孔100μL，4℃孵育过夜；弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次5min；加入封闭液，每孔150μL，37℃孵育1h；弃去封闭液，加入磷酸化AKT（pS473）一抗，每孔100μL，37℃孵育1h；洗涤后，加入HRP标记的二抗，每孔100μL，37℃孵育1h；再次洗涤后，加入TMB底物液，每孔100μL，室温避光孵育15min；加入终止液，每孔50μL，震荡混匀。
使用博清生物酶标仪检测450nm波长下的吸光度（OD值），设置空白孔（不加样品），3个复孔，以OD值反映细胞内AKT激酶的磷酸化活性水平。
3、仪器性能验证实验
灵敏度检测：配制一系列梯度浓度的磷酸化底物标准品（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L），采用TR-FRET方法，通过博清生物酶标仪检测荧光信号，以空白对照组信号均值+3倍标准差作为检测限，评估仪器灵敏度。
重复性检测：选取3个不同浓度的激酶样品（低、中、高），每个浓度设置6个复孔，分别进行批内检测（同一批次实验）和批间检测（连续3天实验），计算变异系数（CV），评估仪器的重复性。
线性检测：采用不同浓度的重组AKT1激酶（0~10U/mL），通过TR-FRET方法检测，以激酶浓度为横坐标，R值为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性相关系数（R²），评估仪器的线性响应能力。
二、结果
（一）博清生物酶标仪对体外激酶磷酸化活性的检测效能
基于TR-FRET技术，利用博清生物酶标仪检测不同浓度重组AKT1激酶的磷酸化活性，结果显示，随着AKT1激酶浓度的升高，665nm与620nm荧光强度的比值（R值）呈明显的剂量依赖性升高，线性相关系数R²=0.996，表明博清生物酶标仪对激酶浓度的响应具有良好的线性关系。
与对照酶标仪平行检测结果对比显示，两种仪器检测的R值趋势一致，且博清生物酶标仪检测的R值变异系数更小（低浓度组CV=0.82%，中浓度组CV=0.65%，高浓度组CV=0.58%），表明其检测稳定性更优。空白对照组与阴性对照组的R值差异显著（P<0.001），说明该检测体系特异性良好，可有效区分磷酸化与非磷酸化底物。
（二）博清生物酶标仪对细胞内激酶磷酸化活性的检测效能
采用ELISA技术，利用博清生物酶标仪检测不同浓度渥曼青霉素处理后Jurkat细胞内AKT激酶的磷酸化活性，结果显示，随着渥曼青霉素浓度的升高，细胞内AKT磷酸化水平（OD值）呈剂量依赖性降低，当渥曼青霉素浓度达到100nmol/L时，OD值降至最低，与空白对照组（未加抑制剂）相比差异显著（P<0.001），表明博清生物酶标仪可灵敏捕捉细胞内激酶磷酸化活性的动态变化，能够有效评估抑制剂对激酶活性的抑制效果。
同时，检测结果显示，同一浓度样品的复孔OD值变异系数均<1.0%，表明该方法具有良好的重复性，可满足细胞内激酶磷酸化活性的定量检测需求。
（三）博清生物酶标仪的性能验证结果
灵敏度检测结果显示，博清生物酶标仪对磷酸化底物标准品的检测限为0.01mg/L，低于传统酶标仪的检测限（0.05mg/L），表明其具有更高的检测灵敏度，可检测低丰度磷酸化底物的信号。
重复性检测结果显示，批内检测的CV值为0.52%~0.89%，均≤1.0%；批间检测的CV值为0.95%~1.32%，均≤1.5%，符合科研检测对重复性的要求，表明博清生物酶标仪的检测稳定性良好，可有效减少实验误差。
线性检测结果显示，在激酶浓度0~10U/mL范围内，博清生物酶标仪检测的R值与激酶浓度呈良好的线性关系（R²≥0.99），表明其线性响应能力优异，可实现激酶磷酸化活性的精准定量。
三、讨论
激酶磷酸化活性的精准检测是解析激酶功能、探索疾病分子机制及筛选靶向药物的关键前提。随着生物科研技术的不断发展，对激酶检测的高通量、高灵敏度、高稳定性提出了更高要求，而检测仪器的性能直接决定了检测结果的可靠性与准确性。博清生物酶标仪作为一款专为科研用户设计的微孔板读数仪，其创新的线性PMT检测技术和双激发光源补偿技术，有效提升了信号检测的灵敏度与稳定性，解决了传统酶标仪在低丰度信号检测中存在的背景干扰大、信号偏差明显等问题。
本研究采用TR-FRET技术与ELISA技术，分别验证了博清生物酶标仪在体外纯化激酶与细胞内激酶磷酸化活性检测中的应用效能。结果表明，该仪器可实现磷酸化信号的精准定量，检测灵敏度达0.01mg/L，显著优于传统检测仪器，能够检测低丰度磷酸化底物，满足微量样品的检测需求；其批内与批间变异系数均控制在较低水平，表明检测结果具有良好的重复性，可有效减少实验误差，提高科研实验的可靠性。同时，在不同浓度激酶及抑制剂作用下，仪器可稳定捕捉磷酸化信号的动态变化，线性相关系数≥0.99，能够准确反映激酶活性差异及抑制剂的抑制效能，为激酶功能研究及靶向药物筛选提供了精准的技术支撑。
与传统放射性检测方法相比，博清生物酶标仪适配的TR-FRET、ELISA等检测方法，无需使用放射性试剂，避免了放射性污染对实验人员健康及环境的危害，且操作简便、检测速度快，可实现高通量检测，大幅提升实验效率；与其他品牌酶标仪相比，博清生物酶标仪采用自主研发的核心算法，具备更灵活的检测模式适配能力，可根据不同科研需求，调整检测参数，适配多种激酶磷酸化检测方法，同时其亲民的性价比的，更适合中小型科研实验室及高校实验室的推广应用。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪凭借其高灵敏度、高稳定性、高线性度及便捷的操作性能，可有效满足生物科研中激酶磷酸化活性的检测需求，无论是体外纯化激酶的活性分析，还是细胞内激酶的磷酸化检测，均能提供精准、可靠的实验数据。该仪器的应用，不仅能够提升激酶磷酸化检测的效率与质量，还能为激酶功能研究、疾病分子机制探索及靶向药物筛选提供有力的技术支撑，具有广阔的推广应用前景。未来，可进一步拓展博清生物酶标仪在多重激酶磷酸化检测、高通量药物筛选等领域的应用，为生物科研事业的发展注入新的动力。
