蛋白质作为生命活动的核心执行者，其纯化质量直接决定后续结构解析、功能验证、药物研发等研究的可靠性与准确性。层析技术是蛋白质纯化的主流技术，其中亲和层析因特异性强、纯化效率高，被广泛应用于重组蛋白的分离纯化，而洗脱液的分配是亲和层析流程中实现目标蛋白与层析介质分离、收集目标组分的关键步骤。洗脱液分配的精准度直接影响目标蛋白的回收率与纯度——分配体积偏差过大易导致目标蛋白稀释或过度浓缩，影响后续活性检测；重复性不佳则会造成实验数据波动，降低研究结果的可信度。
博清生物科技（南京）有限公司研发的自动分液系统是一款具备高精度、高重复性的自动化液体处理设备，采用精密蠕动泵与程序化控制技术，可实现多种规格容器的精准分液，适用于生命科学、食品等多领域的液体分配需求。该系统支持多通道并行操作，可灵活适配96孔板、离心管等常用实验容器，能够有效解决传统分液方式的诸多弊端。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、试剂与耗材：重组His标签绿色荧光蛋白（GFP-His）表达菌株（BL21(DE3)）；Ni-NTA亲和层析柱（1mL）；His标签蛋白纯化试剂盒（含结合缓冲液、洗脱缓冲液）；Bradford蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒；无菌离心管（1.5mL）、96孔酶标板；无酶水。
2、仪器设备：博清生物自动分液系统；高速冷冻离心机；酶标仪；垂直电泳系统超净工作台。
（二）实验方法
1、重组GFP-His蛋白的诱导表达与粗提
将GFP-His表达菌株接种至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600=0.6~0.8，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，25℃诱导表达12h。诱导结束后，8000r/min、4℃离心10min收集菌体，加入结合缓冲液重悬，超声破碎（功率300W，工作3s，间隔5s，总时长10min），12000r/min、4℃离心20min，收集上清液，即为GFP-His蛋白粗提液，-20℃保存备用。
2、博清生物自动分液系统参数优化
以洗脱缓冲液为研究对象，探究博清生物自动分液系统的分液体积、分液速度对分配精准度的影响。设置分液体积梯度（50μL、100μL、200μL、500μL），分液速度梯度（低速、中速、高速），每个参数组合重复3次，采用酶标仪测定实际分液体积，计算分液准确度（实际体积与设定体积的偏差率）与重复性（变异系数CV），优化得到最佳分液参数。
3、基于自动分液系统的蛋白质亲和纯化流程
采用Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化，流程如下：1）层析柱平衡：通过博清生物自动分液系统，以优化后的参数向Ni-NTA层析柱中加入结合缓冲液，流速1mL/min，平衡5柱体积；2）上样：将GFP-His蛋白粗提液通过自动分液系统上样至层析柱，流速0.5mL/min，收集穿透液；3）洗涤：用自动分液系统加入洗涤缓冲液，流速1mL/min，洗涤3柱体积，去除杂蛋白，收集洗涤液；4）洗脱与分配：通过自动分液系统向层析柱中加入洗脱缓冲液，设置单次分液体积100μL，分5次洗脱，每次洗脱后通过系统将洗脱液精准分配至1.5mL离心管中，收集洗脱组分（E1~E5）；5）层析柱再生：用再生缓冲液冲洗层析柱，保存备用。
以传统手动移液方式作为对照，按照相同的纯化流程进行操作，手动分配洗脱液，收集洗脱组分（M1~M5）。
4、纯化效果检测
1）蛋白浓度测定：采用Bradford法，分别测定自动分液组与手动分液组各洗脱组分的蛋白浓度，酶标仪测定波长595nm，每个样品重复3次，计算平均值与CV值。
2）蛋白纯度检测：采用SDS-PAGE电泳法，分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，上样量20μL，电泳结束后经考马斯亮蓝染色、脱色，观察蛋白条带，采用ImageJ软件分析目标蛋白（GFP-His，分子量约27kDa）的纯度。
3）蛋白活性检测：采用荧光分光光度计测定GFP-His蛋白的荧光强度（激发波长488nm，发射波长507nm），以荧光强度反映蛋白活性，每个样品重复3次，计算平均值。
二、结果与分析
（一）博清生物自动分液系统参数优化结果
不同分液体积与分液速度对博清生物自动分液系统分配效果的影响。结果显示，在相同分液速度下，随着分液体积的增加，准确度误差逐渐降低，重复性CV值逐渐减小；在相同分液体积下，中速分液时的准确度与重复性最优，低速分液耗时较长，高速分液易导致液体飞溅，降低分配精准度。当分液体积为100μL、分液速度为中速时，系统的准确度误差仅为0.82%，CV值为1.23%，均达到最优水平，因此确定该参数为后续洗脱液分配的最佳参数。
（二）自动分液与手动分液的精准度及重复性对比
以优化后的参数（100μL、中速）进行洗脱液分配，对比博清生物自动分液系统与传统手动分液方式的精准度与重复性。自动分液组的准确度误差为0.82±0.11%，显著低于手动分液组的5.23±0.65%（P<0.05）；自动分液组的重复性CV值为1.23±0.16%，显著低于手动分液组的8.35±0.92%（P<0.05）。表明博清生物自动分液系统可有效提升洗脱液分配的精准度与重复性，减少人为操作误差的影响。
（三）两种分液方式对蛋白纯化效果的影响
1、蛋白浓度与回收率
自动分液组与手动分液组各洗脱组分的蛋白浓度及总回收率。自动分液组的洗脱组分主要集中在E2~E4，各组分蛋白浓度的CV值为1.35±0.18%，总回收率为89.62±2.35%；手动分液组的洗脱组分分布较分散，各组分蛋白浓度的CV值为8.76±0.95%，总回收率为72.35±3.12%。自动分液组的总回收率显著高于手动分液组（P<0.05），且各组分浓度分布更均匀，表明自动分液系统可减少洗脱液分配不均导致的蛋白损失，提升纯化回收率。
2、蛋白纯度
自动分液组与手动分液组均能纯化得到GFP-His目标蛋白（27 kDa），但自动分液组的洗脱组分（E2~E4）无明显杂蛋白条带，经ImageJ软件分析，目标蛋白纯度达95.32±1.25%；手动分液组的洗脱组分存在少量杂蛋白条带，目标蛋白纯度为82.65±2.35%，显著低于自动分液组（P<0.05）。表明博清生物自动分液系统可通过精准分配洗脱液，减少杂蛋白的共洗脱，提升目标蛋白的纯化纯度。
3、蛋白活性
荧光强度检测结果显示，自动分液组纯化后目标蛋白的荧光强度为12568±325 a.u.，手动分液组为10235±412 a.u.，自动分液组的荧光强度显著高于手动分液组（P<0.05）。表明博清生物自动分液系统的精准分配可减少洗脱液对蛋白构象的破坏，更好地保留目标蛋白的活性。
（四）实验效率与交叉污染风险评估
对比两种分液方式的实验耗时，处理12个样品时，博清生物自动分液系统的洗脱液分配耗时为8.5±1.2min，传统手动分液耗时为35.6±2.5min，自动分液系统的实验效率提升约76%。同时，自动分液系统采用封闭式管路设计，可避免手动移液过程中样品飞溅、交叉污染的问题，经检测，自动分液组的样品交叉污染率为0，显著低于手动分液组的6.7%（P<0.05），进一步验证了该系统在高通量实验中的优势。
三、讨论
蛋白质纯化过程中，洗脱液的分配质量直接决定目标蛋白的回收率、纯度及活性，传统手动分液方式受人为操作差异的影响，难以实现洗脱液的精准、高效分配，已逐渐无法满足高通量、精细化的科研需求。自动化分液技术凭借其精准度高、重复性好、效率高的优势，已成为生命科学实验中液体处理的重要手段。
本研究通过优化博清生物自动分液系统的参数，发现当分液体积为100μL、分液速度为中速时，系统的分液准确度与重复性最优，这与该系统采用的精密蠕动泵及程序化控制技术密切相关——精密蠕动泵可实现液体的精准输送，避免流速波动导致的分配偏差，而程序化控制则可消除人为操作的随机性，确保每一次分液操作的一致性。与传统手动分液方式相比，博清生物自动分液系统的准确度误差降低约84%，重复性CV值降低约85%，显著提升了洗脱液分配的精准度与稳定性，这与同类自动化分液设备的研究结果一致。
在蛋白质纯化应用中，博清生物科技（南京）有限公司研发的自动分液系统通过精准分配洗脱液，实现了目标蛋白的高效回收与高纯度纯化——总回收率提升约24%，目标蛋白纯度提升约15%，且蛋白活性保持良好。这是因为精准的洗脱液分配可避免洗脱不充分导致的蛋白残留，同时减少过度洗脱带来的杂蛋白共洗脱，从而提升纯化效果。此外，该系统支持多通道并行操作，可显著提升实验效率，同时封闭式管路设计有效降低了样品交叉污染风险，更适用于高通量蛋白质纯化实验。
本研究证实，博清生物科技（南京）有限公司研发的自动分液系统可通过优化分液参数，实现蛋白质纯化过程中洗脱液的精准、高效分配，其分液准确度与重复性显著优于传统手动分液方式。该系统可提升目标蛋白的纯化回收率与纯度，更好地保留蛋白活性，同时提高实验效率、降低样品交叉污染风险，能够有效适配生命科学研究中高通量、高精度的蛋白质纯化需求。博清生物自动分液系统为蛋白质纯化实验的自动化、标准化提供了可靠的技术手段，具有广阔的推广应用前景。
