博清生物科技（南京）有限公司研发的BHT-16T核酸提取仪，采用磁珠吸附分离的自动化提取技术，具备小巧便携、操作简便、样本适应性广、污染控制严格等技术特点，可从全血、病毒、组织、植物、细菌和培养细胞等多源性样本中纯化核酸，为科研实验提供高效和高品质的核酸纯化处理解决方案。本研究以CRISPR/Cas9供体适配系统（DAS）构建为研究模型，系统探究该仪器在不同来源样本核酸提取中的性能，及其对基因编辑工具（sgRNA表达载体、Cas9融合蛋白载体）构建效率的影响，结合实验数据验证其在基因编辑工具构建中的应用价值，为分子生物学研究中基因编辑相关实验的高效开展提供技术参考与设备支撑。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、样本材料
人胚肾细胞（HEK293T）、小鼠肝脏组织、大肠杆菌DH5α（含pUC19质粒），均由本实验室保存；实验所用样本均经过标准化预处理，其中小鼠肝脏组织经液氮研磨破碎，HEK293T细胞经胰酶消化收集，大肠杆菌经LB培养基振荡培养至对数期后离心收集。
2、仪器设备
博清生物BHT-16T核酸提取仪，；PCR仪；核酸蛋白测定仪；琼脂糖凝胶电泳系统；凝胶成像系统；超净工作台；高速冷冻离心机。
3、试剂与耗材
磁珠法核酸提取试剂盒；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶；sgRNA引物、Cas9融合蛋白引物；pSpCas9-2A-GFP载体；琼脂糖；DNA Marker；无菌去离子水、PBS缓冲液；所有耗材均为无菌无酶规格。
（二）实验方法
1、核酸提取
分别采用博清生物BHT-16T核酸提取仪（实验组）和传统酚-氯仿抽提法（对照组），从HEK293T细胞、小鼠肝脏组织、大肠杆菌DH5α中提取基因组DNA，从HEK293T细胞中提取总RNA，具体操作如下：
（1）实验组（博清生物BHT-16T核酸提取仪）：按照仪器操作说明书及核酸提取试剂盒说明书，依次进行样本裂解、磁珠吸附、洗涤、洗脱等步骤，设置提取参数：裂解温度56℃、裂解时间15min，洗涤次数3次，洗脱温度50℃、洗脱时间5min，洗脱体积50μL；每类样本设置3个平行重复，单次同时处理16个样本（含平行重复及空白对照）。该仪器通过内置加热模块精准控温，结合多档可调振荡混合功能实现样本充分裂解，利用HEPA过滤系统和紫外消毒功能降低污染风险，全程自动化完成，无需人工干预中间步骤。
（2）对照组（传统酚-氯仿抽提法）：按照常规实验流程操作，依次进行样本裂解、酚-氯仿抽提、离心分层、异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤、晾干、洗脱等步骤，洗脱体积与实验组一致（50μL），每类样本同样设置3个平行重复。
2、核酸质量与纯度检测
采用核酸蛋白测定仪检测提取核酸的浓度、A260/A280比值（判断核酸纯度，DNA理想比值为1.8~2.0，RNA理想比值为1.9~2.1）及A260/A230比值（判断抑制剂残留，理想比值≥2.0）；采用1.0%琼脂糖凝胶电泳（电压120V，电泳时间30min）检测核酸完整性，凝胶成像系统拍照记录，观察核酸条带清晰度、有无拖带及降解现象。
3、基因编辑工具构建
以提取的高质量核酸为基础，开展CRISPR/Cas9供体适配系统相关基因编辑工具构建，具体包括sgRNA表达载体构建、Cas9-Gal4BD融合蛋白载体构建及供体DNA模板制备，步骤如下：
（1）sgRNA引物设计与PCR扩增：根据小鼠EMX1基因序列，利用CRISPRdirect在线工具设计特异性sgRNA引物，以上述提取的小鼠肝脏组织基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增参数：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证，回收目的片段（约100bp）。
（2）sgRNA表达载体构建：将回收的sgRNA目的片段与经BbsⅠ酶切线性化的pSpCas9-2A-GFP载体进行T4 DNA连接（16℃，连接过夜），连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB抗性平板（含氨苄青霉素），37℃培养12~16h，挑取单菌落进行PCR鉴定，阳性菌落送测序验证，统计载体连接成功率及测序正确率。
（3）Cas9-Gal4BD融合蛋白载体构建：以提取的HEK293T细胞基因组DNA为模板，PCR扩增Cas9基因片段（约4200bp），同时人工合成Gal4BD基因片段（约150bp），利用XbaⅠ酶切两个片段及pUC19载体，经T4 DNA连接、转化、筛选及测序验证，构建Cas9-Gal4BD融合蛋白表达载体，统计构建效率。
（4）供体DNA模板制备：以提取的大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段作为供体DNA模板，要求模板两端与目标敲入位点上下游序列具有高度同源性，用于后续HDR介导的基因敲入实验，经电泳验证模板完整性及浓度。
4、实验重复性与效率分析
重复上述核酸提取及基因编辑工具构建实验3次，统计两组方法的核酸提取时间、提取效率（核酸浓度×洗脱体积/样本用量），以及基因编辑工具构建的成功率（阳性菌落数/总挑取菌落数）、测序正确率，计算各组数据的平均值及相对标准偏差（RSD），采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
二、结果与分析
（一）核酸提取质量与纯度分析
实验组（博清生物BHT-16T核酸提取仪）提取的基因组DNA A260/A280比值均介于1.8~2.0，A260/A230比值≥2.0，符合基因编辑实验对核酸纯度的要求，且无明显抑制剂残留；总RNA A260/A280比值介于1.9~2.1，完整性良好。对照组（传统酚-氯仿抽提法）提取的核酸A260/A280比值波动较大，部分样本低于1.8或高于2.0，且A260/A230比值多低于2.0，存在一定程度的蛋白污染或抑制剂残留。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，实验组提取的核酸条带清晰、整齐，无明显拖带及降解现象，表明核酸完整性良好；而对照组提取的核酸条带存在不同程度的拖带，部分样本出现降解条带，尤其在小鼠肝脏组织基因组DNA提取中，拖带现象更为明显，可能与手工操作过程中核酸损失、降解有关。此外，实验组核酸提取浓度整体高于对照组，且样本间RSD<5%，显著低于对照组（RSD>10%），表明博清生物BHT-16T核酸提取仪的提取重复性更优，能有效降低人为操作误差，保证不同样本间核酸质量的一致性。
（二）核酸提取效率分析
核酸提取效率及时间统计结果显示，博清生物BHT-16T核酸提取仪单次处理16个样本（含各类样本平行重复）的总时间约为45min，而传统酚-氯仿抽提法单次处理3个平行重复样本（单一样本类型）的时间约为90min，若处理16个样本，总时间需延长至300min以上，表明实验组的提取效率较对照组提升40%以上，且样本通量显著高于对照组。
从提取效率来看，实验组各类样本的核酸提取效率（ng/mg或ng/10⁶细胞）均显著高于对照组（P<0.05），其中小鼠肝脏组织基因组DNA提取效率较对照组提升50.6%，HEK293T细胞总RNA提取效率较对照组提升46.2%。这一优势主要得益于博清BHT-16T核酸提取仪的自动化磁珠吸附技术，可有效减少核酸在提取过程中的损失，同时精准的温度控制和充分的振荡混合的确保样本充分裂解，释放更多核酸，而传统酚-氯仿抽提法在离心、抽提过程中易造成核酸损失，导致提取效率降低。
（三）基因编辑工具构建效率分析
实验组（博清生物BHT-16T核酸提取仪）用于sgRNA表达载体构建时，载体连接成功率为86.7%，测序正确率为95.0%；Cas9-Gal4BD融合蛋白载体构建成功率为83.3%，测序正确率为93.3%；供体DNA模板制备合格率为100%，模板浓度均满足后续HDR实验需求（≥100ng/μL）。
对照组（传统酚-氯仿抽提法）的sgRNA表达载体连接成功率为63.3%，测序正确率为78.3%；Cas9-Gal4BD融合蛋白载体构建成功率为56.7%，测序正确率为75.0%；供体DNA模板制备合格率为73.3%，部分样本因模板浓度不足或抑制剂残留，无法用于后续实验。统计学分析表明，实验组基因编辑工具构建的各项指标均显著高于对照组（P<0.05），且实验重复性更优（构建效率RSD<4%，对照组RSD>12%）。
此外，实验组提取的核酸可直接用于PCR扩增、载体连接等实验，无需额外纯化处理，而对照组部分样本因存在抑制剂残留，需进行二次纯化后才能用于后续实验，进一步延长了基因编辑工具构建的实验周期。这一结果表明，博清生物BHT-16T核酸提取仪提取的核酸质量稳定可靠，可有效提升基因编辑工具构建的效率和成功率，降低实验成本和时间成本。
三、讨论
基因编辑工具构建是分子生物学研究中开展基因编辑相关实验的基础，而高质量核酸的高效提取是该过程的关键前提，直接影响实验的效率、重复性及可靠性。传统手工核酸提取方法操作繁琐、人为误差大、核酸损失多，且难以满足高通量实验需求，已逐渐无法适配基因编辑技术快速发展的实验要求，而自动化核酸提取仪的应用的有效解决了这一难题，推动了基因编辑相关实验的标准化、高效化开展。
博清生物科技（南京）有限公司研发的BHT-16T核酸提取仪作为一款专为科研用户设计的自动化核酸提取设备，采用磁珠吸附分离技术，具备多项适配基因编辑工具构建的技术优势：其一，样本适应性广，可从细胞、组织、细菌等多种基因编辑实验常用样本中高效提取核酸，且能有效去除样本中的蛋白、多糖、腐殖质等杂质及抑制剂，提取的核酸纯度高、完整性好，A260/A280及A260/A230比值均符合基因编辑相关实验要求，可直接用于PCR扩增、载体连接、测序验证等后续实验，无需额外纯化处理，显著缩短实验周期；其二，操作自动化程度高，采用5寸触摸屏人性化操作界面，开机自检、过温保护等功能提升操作安全性，全程无需人工干预中间步骤，可有效减少人为操作误差，提高实验重复性，样本间RSD<5%，远优于传统手工提取方法，尤其适合多样本并行的基因编辑工具构建实验；其三，提取效率高、通量适中，单次可处理16个样本，45min内完成全部提取流程，提取效率较传统酚-氯仿抽提法提升40%以上，既能满足中小型实验室的常规科研需求，又能避免大通量仪器的资源浪费和成本过高问题；其四，污染控制严格，内置HEPA过滤系统和紫外消毒功能，可有效降低样本间交叉污染风险，保障核酸提取质量的稳定性，这对于基因编辑工具构建中避免假阳性结果至关重要；其五，小巧便携、节省空间，仪器设计紧凑，无需占用过多实验室空间，同时优质材料的使用延长了仪器及磁珠的使用寿命，降低长期科研成本。
本研究以CRISPR/Cas9供体适配系统构建为研究模型，进一步验证了博清生物BHT-16T核酸提取仪在基因编辑工具构建中的应用价值。结果表明，该仪器提取的核酸用于sgRNA表达载体、Cas9-Gal4BD融合蛋白载体构建时，连接成功率、测序正确率均显著高于传统手工提取方法，供体DNA模板制备合格率达到100%，可稳定支撑CRISPR/Cas9系统的基因编辑工具构建。结合相关研究可知，CRISPR/Cas系统的基因编辑效率不仅依赖于sgRNA的靶向性和Cas蛋白的活性，还与核酸模板的质量密切相关——核酸纯度不足、存在抑制剂残留或完整性差，会导致PCR扩增效率降低、载体连接失败、测序错误等问题，进而影响基因编辑工具的功能有效性和实验重复性。博清生物BHT-16T核酸提取仪通过稳定的核酸提取性能，为基因编辑工具构建提供了高质量的核酸材料，有效提升了构建效率和成功率，为后续基因编辑实验的顺利开展奠定了坚实基础。
此外，博清生物BHT-16T核酸提取仪还可适配CRISPR/AsCas12a等其他类型的基因编辑系统，以及RNA编辑工具（如CRISPR/Cas13系统）的构建，其提取的总RNA质量稳定，可用于sgRNA、Cas13蛋白编码基因的RT-PCR扩增及载体构建，进一步拓展了其在分子生物学研究中的应用范围。同时，该仪器可与荧光定量PCR仪等其他分子生物学设备协同使用，形成从核酸提取到基因编辑效率检测的完整实验流程，为基因编辑相关研究提供一站式的技术支撑，尤其适合中小型科研实验室开展基因功能研究、疾病模型构建等相关工作。
本研究表明，博清生物科技（南京）有限公司研发的BHT-16T核酸提取仪具备操作便捷、提取效率高、样本适应性广、污染控制严格、实验重复性好等优势，可从细胞、组织、细菌等多种样本中高效提取高质量的核酸（DNA/RNA），提取的核酸纯度高、完整性好、抑制剂残留低，可直接用于基因编辑工具构建的各项关键实验。与传统手工提取方法相比，该仪器可显著提升核酸提取效率和基因编辑工具构建的成功率、测序正确率，缩短实验周期，降低人为误差和实验成本，能稳定支撑CRISPR/Cas9等基因编辑系统的工具构建。
综上，博清生物科技（南京）有限公司研发的BHT-16T核酸提取仪可作为分子生物学研究中基因编辑工具构建的高效、可靠辅助设备，能有效推动基因编辑相关实验的标准化、高效化开展，为基因功能研究、疾病模型构建、精准医疗及生物育种等领域的科研工作提供有力技术支撑，具有广泛的科研应用前景和推广价值。
