单链DNA（ssDNA）作为基因编辑中的修复模板、NGS文库构建的关键原料、液态活检中循环游离DNA（cfDNA）的核心检测对象，其浓度的精准定量直接影响实验的重复性与可靠性。目前ssDNA定量常用方法包括紫外分光光度法和荧光染料法，其中紫外分光光度法依赖核酸在260 nm处的特征吸收峰，操作简便但灵敏度低，易受蛋白、RNA等杂质干扰；荧光染料法则基于特异性染料与ssDNA的结合反应，荧光信号强度与靶分子浓度呈正相关，具有更高的灵敏度和特异性，已成为科研领域主流的定量技术。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计作为一款紧凑型微量检测设备，专为核酸与蛋白定量设计，具备样本需求量少、检测速度快、操作便捷等特点。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器：博清生物荧光计；紫外分光光度计；移液器；高速冷冻离心机。
2、试剂：ssDNA标准品；ssDNA定量检测试剂盒；NaCl、BSA（牛血清白蛋白）、Tris-HCl缓冲液；所有实验用水均为超纯水。
3、耗材：0.5mL无酶PCR管；移液器吸头。
（二）实验方法
1、标准品配制
将ssDNA标准品用稀释缓冲液溶解，制备浓度为200ng/μL的储备液，随后梯度稀释为1ng/μL、5ng/μL、20ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL的标准工作液，置于冰上避光保存，现配现用。
2、标准曲线构建
按照试剂盒说明书配制检测工作液（荧光染料与稀释缓冲液按1:199体积比混合，避光涡旋混匀）。取190μL检测工作液加入各标准品反应管中，再分别加入10μL不同浓度的ssDNA标准工作液，终体积为200μL，轻轻涡旋振荡3s，避免产生气泡。室温（25℃）避光孵育2min后，将反应管放入博清生物荧光计，选择“ssDNA High Sensitivity”检测程序，每个浓度设置3个平行复孔，记录荧光信号值（RFU）。以ssDNA标准品浓度为横坐标，平均荧光信号值为纵坐标，采用线性回归法构建标准曲线，计算相关系数（R²）与回归方程。
3、灵敏度检测
将ssDNA标准品稀释至50pg/μL、100pg/μL、200pg/μL、500pg/μL，按照2.2.2的方法进行检测，每个浓度设置5个平行复孔。以空白对照（190μL检测工作液+10μL稀释缓冲液）的荧光信号值均值加3倍标准差（Mean+3SD）作为检出限（LOD），判断仪器对低浓度ssDNA的检测能力。
4、重复性验证
选取低（20ng/μL）、中（100ng/μL）、高（180ng/μL）三个浓度的ssDNA标准品，按照2.2.2的方法进行检测。批内重复性：同一批次内每个浓度重复检测6次，计算变异系数（CV）；批间重复性：连续3天进行检测，每天每个浓度设置3个平行复孔，计算总变异系数。
5、抗干扰性实验
模拟实际样本中可能存在的干扰物质，分别在100ng/μL ssDNA标准品中加入不同浓度的NaCl（50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L）、BSA（0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL），以不含干扰物质的ssDNA标准品作为对照，按照2.2.2的方法进行检测，每个处理设置3个平行复孔。计算相对误差（RE），评估干扰物质对定量结果的影响（RE绝对值<5%视为无显著干扰）。
6、两种方法对比实验
选取3份人工配制的ssDNA样本（浓度分别为30ng/μL、80ng/μL、150ng/μL），分别采用博清生物荧光计和紫外分光光度法进行定量检测。紫外分光光度法以稀释缓冲液为空白对照，测定260nm处的吸光度（OD260），按公式ssDNA浓度（ng/μL）=33×（OD260-OD310）×稀释倍数计算样本浓度。每种方法每个样本设置3个平行复孔，比较两种方法的检测结果差异。
二、结果与分析
（一）标准曲线构建结果
博清生物荧光计检测不同浓度ssDNA标准品的荧光信号值显示，随着ssDNA浓度的升高，荧光信号值呈显著线性上升趋势。线性回归分析结果表明，在1~200 ng范围内，标准曲线的回归方程为y=125.3x+89.6（y为荧光信号值RFU，x为ssDNA浓度ng），相关系数R²=0.998，表明该仪器在该浓度范围内具有良好的线性响应能力，可满足ssDNA定量检测的线性需求。
（二）灵敏度检测结果
空白对照的荧光信号值均值为82.3±3.1RFU，据此计算检出限（LOD）为48.6pg/μL。低浓度ssDNA检测结果显示，50pg/μL浓度组的荧光信号值（135.7±4.8RFU）显著高于LOD，且检测结果稳定（CV=3.5%）；100pg/μL及以上浓度组的荧光信号值与浓度呈良好线性关系（R²=0.996）。表明博清生物荧光计对ssDNA的检测限低至50pg/μL，具备痕量ssDNA的定量检测能力，可满足循环肿瘤DNA等微量样本的检测需求。
（三）重复性验证结果
批内重复性实验中，低、中、高三个浓度ssDNA的变异系数（CV）分别为1.21%、0.98%、0.85%，均小于1.5%；批间重复性实验中，三个浓度的总变异系数分别为1.35%、1.12%、0.92%，同样低于1.5%。结果表明，博清生物荧光计在ssDNA定量检测中具有优异的重复性和稳定性，可有效保证实验结果的可靠性。
（四）抗干扰性实验结果
不同浓度NaCl和BSA对ssDNA定量结果的影响显示，当NaCl浓度≤200mmol/L、BSA浓度≤1.0mg/mL时，定量结果的相对误差（RE）均小于5%，与无干扰对照组相比无显著差异（P>0.05）。表明博清生物荧光计在常见盐离子和蛋白存在的情况下，仍能保持稳定的定量准确性，对样本中常见污染物的耐受性较强，可减少样本预处理步骤，提高实验效率。
（五）两种方法对比实验结果
博清生物荧光计与紫外分光光度法的检测结果对比显示，对于3份不同浓度的ssDNA样本，荧光计检测结果的相对误差均小于2%，而紫外分光光度法的相对误差均大于5%，且在低浓度样本（30ng/μL）中，紫外分光光度法的检测结果波动较大（CV=4.8%），显著高于荧光计（CV=1.1%）。表明博清生物荧光计在ssDNA定量中具有更高的准确性和稳定性，尤其适用于低浓度样本的检测。
三、讨论
ssDNA的精准定量是分子生物学实验的关键环节，其浓度准确性直接影响基因编辑效率、NGS文库构建质量及液态活检结果的可靠性。本研究系统评估了博清生物荧光计在ssDNA定量中的性能，结果表明该仪器具备良好的线性响应、高灵敏度、优异的重复性和较强的抗干扰性，综合性能优于传统紫外分光光度法。
线性范围与灵敏度是核酸定量仪器的核心性能指标。本研究中，博清生物荧光计在1~200ng范围内构建的标准曲线相关系数R²=0.998，线性关系良好，覆盖了大多数科研实验中ssDNA的浓度范围（如CRISPR-Cas9编辑中修复模板浓度通常为50~200ng/μL，NGS文库构建中样本浓度通常为1~100ng/μL）。同时，该仪器的检测限低至50pg/μL，远低于紫外分光光度法（检测限约1ng/μL），可满足痕量ssDNA样本（如血浆cfDNA、病毒基因组ssDNA中间体）的定量需求，这一优势得益于荧光染料与ssDNA的特异性结合反应，使得荧光信号具有更高的信噪比。
重复性与抗干扰性是保证实验结果可靠性的重要前提。本研究中，博清生物荧光计的批内与批间变异系数均小于1.5%，表明仪器检测稳定性优异，可有效减少实验误差；在常见盐离子（NaCl≤200mmol/L）和蛋白（BSA≤1.0mg/mL）存在下，定量结果的相对误差均小于5%，说明仪器对样本中常见污染物的耐受性较强，无需复杂的样本纯化步骤，可显著提高实验效率。这一特点与博清生物荧光计的硬件设计（如专用光学滤光系统、高灵敏度检测器）及荧光染料的特异性结合特性密切相关。
与传统紫外分光光度法相比，博清生物荧光计还具有样本需求量少（1~20μL）、检测速度快（单次检测<5min）、操作便捷等优势。紫外分光光度法通常需要2μL以上样本，且易受蛋白、RNA等杂质干扰，而荧光计仅需微量样本即可实现精准定量，尤其适用于珍贵样本（如临床活检样本、稀有微生物样本）的检测；同时，该仪器配备直观的操作界面，可快速完成标准曲线构建与样本检测，无需复杂的参数设置，降低了实验操作门槛。
本研究也存在一定局限性：未考察样本中RNA、双链DNA等核酸类杂质对检测结果的影响，后续可进一步优化实验体系，通过预处理（如加热变性、酶解）去除核酸类杂质，提高检测特异性；同时，未开展临床样本（如血浆、组织匀浆）的验证实验，未来可扩大样本类型，评估仪器在实际科研场景中的应用效能。
本研究证实，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计在ssDNA定量检测中具有线性范围宽（1~200ng）、灵敏度高（检测限50pg/μL）、重复性好（CV<1.5%）、抗干扰性强等优势，且样本需求量少、检测速度快、操作便捷，综合性能优于传统紫外分光光度法。该仪器可有效满足基因编辑、NGS文库构建、液态活检等科研场景中ssDNA定量的需求，为分子生物学研究提供可靠的技术支撑，具有广阔的推广应用前景。
