博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪系列产品，融合自主开发的实时动态精准温控技术及多通道荧光检测系统，具备轻巧便携、操作简便及检测高效等特点，可适配移动实验室、现场检测等多种应用场景。本研究以穿心莲内酯干预铜绿假单胞菌为模型，利用博清生物BOD-16PE型荧光定量PCR仪检测耐药相关mexB基因的表达变化，验证该仪器在药物对病原体基因表达影响研究中的应用效能，为抗菌药物研发及耐药性防控提供技术参考。
一、材料与方法
（一）实验材料
菌株：铜绿假单胞菌标准株PAO1。药物：穿心莲内酯（纯度≥98%，）。仪器：博清生物BOD-16PE型荧光定量PCR仪（4通道荧光检测，16孔反应模块，7寸触摸屏操作）、博清生物BHT-16T型核酸提取仪、超纯水机（博清生物）、高速冷冻离心机。试剂：细菌总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green qPCR Mix。
（二）细菌培养与药物干预
将铜绿假单胞菌PAO1株接种于LB液体培养基，37℃、180r/min振荡培养至对数生长期（OD₆₀₀=0.6~0.8）。设置药物浓度梯度为50、100、150、200μg/mL，同时设立无药物干预组作为对照组，每组3个复孔。将不同浓度穿心莲内酯加入菌液中，37℃继续培养24h，收集菌液用于后续RNA提取。
（三）总RNA提取与逆转录
按照细菌总RNA提取试剂盒说明书，采用博清生物BHT-16T型核酸提取仪自动化提取各组菌液总RNA，通过超微量分光光度计检测RNA纯度（A₂₆₀/A₂₈₀=1.8~2.0）及浓度，琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。以总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，反应条件：42℃逆转录60min，70℃灭活15min，产物置于-20℃保存备用。
（四）qPCR检测与仪器性能验证
qPCR反应体系（20μL）：SYBR Green qPCR Mix 10μL，上、下游引物各0.8μL（10 μmol/L），cDNA模板2μL，无酶水6.4μL。设置反应程序：预变性95℃ 3min；循环扩增95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环，同时采集荧光信号；熔解曲线分析95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，升温速率0.5℃/s。
仪器性能验证：以梯度稀释的mexB基因重组质粒（10¹~10⁹ 拷贝/μL）为模板构建标准曲线，计算相关系数（R²）及扩增效率；对同一批样品进行3次重复检测，计算Ct值的变异系数（CV）；通过熔解曲线分析验证扩增特异性，确保单一峰值无引物二聚体。
二、结果
（一）博清生物荧光定量PCR仪性能验证结果
标准曲线分析显示，mexB基因在10¹~10⁹ 拷贝/μL范围内线性关系良好，标准曲线方程为y=-3.35x+38.62，相关系数R²=0.999，扩增效率为99.2%，符合qPCR检测的技术要求（扩增效率90%~110%，R²≥0.99）。重复性实验中，同一样品3次重复检测的Ct值变异系数为1.2%~2.8%，均<3%，表明仪器检测重复性优良。熔解曲线分析显示，mexB基因及内参基因均呈现单一尖锐峰值，无引物二聚体及非特异性扩增条带，证实引物特异性良好。
（二）穿心莲内酯对铜绿假单胞菌mexB基因表达的影响
与对照组相比，不同浓度穿心莲内酯干预后，铜绿假单胞菌mexB基因mRNA相对表达量均显著下调（P<0.05），且呈现一定的浓度依赖性趋势。其中，50、100、150、200μg/mL组mexB基因相对表达量分别为0.04±0.03、0.06±0.07、0.09±0.03、0.04±0.03，对照组为0.24±0.04。各组间比较显示，穿心莲内酯浓度对mexB基因表达的抑制作用无显著统计学差异（P>0.05），提示在实验浓度范围内，穿心莲内酯对mexB基因的抑制效应趋于稳定。
三、讨论
铜绿假单胞菌的耐药性主要与外排泵系统过度表达相关，mexAB-oprM外排泵是其最重要的耐药外排泵之一，mexB基因作为该外排泵的核心功能基因，其表达水平直接影响细菌对药物的耐受能力。穿心莲内酯作为一种天然中草药活性成分，已被证实具有广谱抗菌及逆转细菌耐药性的作用，但其对铜绿假单胞菌外排泵基因表达的调控机制尚需深入研究。
本研究采用博清生物BOD-16PE型荧光定量PCR仪，成功检测了穿心莲内酯干预后铜绿假单胞菌mexB基因的表达变化。仪器性能验证结果表明，该仪器具备优良的线性关系、扩增效率及重复性，且4通道荧光检测系统可同时适配多种引物及探针，满足多重检测需求。其内置的7寸触摸屏及独立运行功能，无需连接电脑即可完成实验操作，适配实验室常规检测及现场快速分析场景，与传统大型qPCR仪相比更具灵活性。
实验结果显示，穿心莲内酯可显著下调铜绿假单胞菌mexB基因的mRNA表达量，提示其可能通过抑制外排泵基因表达，减少抗菌药物的外排，从而增强细菌对药物的敏感性，这与李洪涛等的研究结果一致。该结果进一步证实，博清生物荧光定量PCR仪可精准捕捉药物作用下病原体基因表达的细微变化，为阐明药物抗菌机制提供可靠的定量依据。
内参基因的选择是确保qPCR结果准确性的关键，需满足在不同实验条件下表达稳定的特点。本研究选用16S rRNA基因为内参，其在铜绿假单胞菌中高度保守且表达稳定，经GeNorm软件评估，其表达稳定性M值<0.5，符合内参基因的选择标准。博清生物科技（南京）有限公司研发的qPCR仪自带的数据分析软件可自动完成内参校正及相对定量计算，简化了数据处理流程，提高了实验效率。
博清生物科技（南京）有限公司研发的BOD-16PE型荧光定量PCR仪具备高灵敏度、高稳定性及操作便捷等优势，可有效应用于药物对病原体基因表达影响的定量分析。本研究通过该仪器证实穿心莲内酯可下调铜绿假单胞菌mexB基因表达，为天然药物抗菌机制研究及耐药性干预提供了技术支撑。该仪器在病原体核酸定量检测、药物研发及临床诊断等领域具有广阔的应用前景。
