三气培养箱是专为敏感细胞培养设计的核心设备，通过精确控制箱内5% CO₂（维持细胞培养液pH稳定）、可调O₂浓度（模拟不同组织的氧分压环境）及饱和湿度、恒定温度，为细胞提供接近体内的生长条件。博清生物科技（南京）有限公司作为专注于生命科学仪器研发的企业，其生产的三气培养箱在控温精度、气体调控稳定性及抑菌性能等方面进行了优化设计。
一、材料与方法
（一）实验材料
实验动物：SPF级C57BL/6小鼠（6-8周龄，体重20-25g）、SD大鼠（2-3周龄，体重50-70g）。
主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（0.25%）、EDTA、青霉素-链霉素双抗；小鼠BMSCs表面标志物（CD29、CD44、CD45、CD90）抗体、大鼠肝细胞功能标志物（白蛋白ALB、细胞色素P450）；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒。
主要仪器：博清生物三气培养箱、对照传统CO₂培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪、酶标仪、超净工作台。
（二）实验方法
1、原代细胞分离与接种
小鼠BMSCs分离：脱颈处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，去除骨两端骨骺，用含10% FBS、1%双抗的DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，经200目筛网过滤，1000r/min离心5min，弃上清，用培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶ cells/mL，接种于6孔板，分别置于博清生物三气培养箱（设定条件：37℃、5% CO₂、5% O₂、饱和湿度）和传统CO₂培养箱（设定条件：37℃、5% CO₂、常氧、饱和湿度）中培养。
大鼠原代肝细胞分离：采用两步胶原酶灌流法。脱颈处死SD大鼠，无菌开腹暴露肝脏，经门静脉缓慢灌注37℃预热的无钙灌流液，待肝脏呈灰白色后，换用含0.05%胶原酶的灌流液继续灌注，直至肝脏质地变软。取出肝脏，撕去包膜，用培养基轻轻吹打分散肝细胞，200目筛网过滤，1000r/min离心5min，弃上清，用含10% FBS、1%双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞率（需>85%），调整细胞浓度为2×10⁶ cells/mL，接种于6孔板，分别置于两种培养箱中培养，原代肝细胞培养箱设定条件：37℃、5% CO₂、2% O₂、饱和湿度。
2、细胞培养与观察
两种细胞均每24h更换一次培养基，倒置显微镜下每日观察细胞形态、贴壁情况及生长状态，记录细胞贴壁时间、汇片时间，并拍摄细胞形态照片。
3、细胞贴壁率检测
细胞接种后24h，弃去培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗2次，去除未贴壁细胞，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞，计数贴壁细胞数量。细胞贴壁率（%）=（贴壁细胞数/接种细胞总数）×100%，每组设置3个复孔，实验重复3次。
4、细胞增殖活性检测
采用CCK-8法检测细胞增殖活性。分别于细胞接种后1d、3d、5d、7d，每组取3个复孔，每孔加入10μL CCK-8试剂，继续培养2h后，用酶标仪在450nm波长下检测吸光度（OD值），以OD值反映细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线。
5、细胞凋亡检测
细胞培养7d后，收集两种培养箱中的细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，加入Annexin V-FITC和PI染色液，避光孵育15min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。
6、细胞表型及功能检测
小鼠BMSCs表型检测：培养7d后收集细胞，用PBS洗涤2次，加入CD29、CD44、CD45、CD90抗体，避光孵育30min，PBS洗涤后，流式细胞仪检测细胞表面标志物表达水平。
大鼠原代肝细胞功能检测：培养5d后，收集细胞培养液，采用ELISA法检测白蛋白（ALB）分泌量；收集细胞，提取总蛋白，Western Blot法检测细胞色素P450蛋白表达水平，以β-actin为内参。
二、结果
（一）博清生物三气培养箱对原代细胞形态的影响
倒置显微镜观察结果显示，小鼠BMSCs接种后，博清生物三气培养箱组细胞贴壁时间更早（约12h），贴壁细胞形态均一，呈典型的梭形，生长排列规则；而传统CO₂培养箱组细胞贴壁时间约为24h，部分细胞形态不规则，存在少量圆形未分化细胞。大鼠原代肝细胞培养24h后，博清生物三气培养箱组细胞贴壁良好，呈多边形，细胞间连接紧密，形成完整的细胞单层；传统CO₂培养箱组细胞贴壁率较低，部分细胞漂浮，细胞形态不完整，细胞间连接松散。
（二）博清生物三气培养箱对原代细胞贴壁率的影响
细胞接种24h后贴壁率检测结果显示，博清生物三气培养箱组小鼠BMSCs贴壁率为（82.3±3.5）%，显著高于传统CO₂培养箱组的（65.7±4.2）%（P<0.05）；博清生物三气培养箱组大鼠原代肝细胞贴壁率为（78.5±2.8）%，明显高于传统CO₂培养箱组的（58.2±3.7）%（P<0.05）。
（三）博清生物三气培养箱对原代细胞增殖活性的影响
CCK-8检测结果显示，两种原代细胞在博清生物三气培养箱中的增殖活性均显著高于传统CO₂培养箱组。小鼠BMSCs培养7d后，博清生物三气培养箱组OD值为（1.85±0.12），传统CO₂培养箱组为（1.23±0.09）（P<0.05）；大鼠原代肝细胞培养7d后，博清生物三气培养箱组OD值为（1.56±0.10），传统CO₂培养箱组为（0.98±0.07）（P<0.05）。生长曲线显示，博清生物三气培养箱组细胞进入对数生长期更早，增殖速度更快，且平台期细胞数量更多。
（四）博清生物三气培养箱对原代细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测结果显示，培养7d后，博清生物三气培养箱组小鼠BMSCs凋亡率为（5.2±1.3）%，显著低于传统CO₂培养箱组的（12.5±2.1）%（P<0.05）；博清生物三气培养箱组大鼠原代肝细胞凋亡率为（6.8±1.5）%，明显低于传统CO₂培养箱组的（15.3±2.4）%（P<0.05）。
（五）博清生物三气培养箱对原代细胞表型及功能的影响
小鼠BMSCs表型检测结果显示，博清生物三气培养箱组细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD29（95.3±2.1）%、CD44（94.6±1.8）%、CD90（96.2±1.5）%，低表达造血干细胞标志物CD45（2.3±0.5）%，其表型纯度显著高于传统CO₂培养箱组（CD29：88.5±2.5%、CD44：87.3±2.2%、CD90：89.6±1.9%、CD45：6.8±1.2%）（P<0.05）。
大鼠原代肝细胞功能检测结果显示，博清生物三气培养箱组细胞培养液中ALB分泌量为（25.3±2.1）μg/mL，显著高于传统CO₂培养箱组的（15.6±1.8）μg/mL（P<0.05）；Western Blot结果显示，博清生物三气培养箱组细胞色素P450蛋白表达水平明显高于传统CO₂培养箱组（P<0.05）。
三、讨论
原代细胞体外培养的核心难点在于维持其体内原始的生长状态和生物学功能，而培养环境的稳定性是实现这一目标的关键。三气培养箱通过精准调控O₂浓度，模拟不同组织细胞的生理氧分压环境（如骨髓微环境氧分压约为2-8%，肝脏组织氧分压约为3-5%），相较于传统CO₂培养箱的常氧环境（21% O₂），更符合原代细胞的生长需求。本研究选用小鼠BMSCs和大鼠原代肝细胞两种不同类型的原代细胞，系统评估了博清生物三气培养箱的应用效能，结果表明该培养箱在原代细胞培养中具有显著优势。
细胞贴壁是原代细胞体外培养的第一步，贴壁率直接影响后续细胞的增殖和功能。本研究发现，博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱组两种原代细胞的贴壁率均显著高于传统CO₂培养箱组，且贴壁时间更早。这可能与博清生物三气培养箱精准的温湿度调控和稳定的气体环境有关，其采用的高精度温度传感器可将温度波动控制在±0.1℃，饱和湿度维持系统可避免细胞因环境干燥导致的贴壁困难，而精准的CO₂浓度调控（±0.1%）可有效维持培养液pH稳定，为细胞贴壁提供良好条件。
细胞增殖活性和凋亡率是评价细胞培养效果的重要指标。本研究中，博清生物三气培养箱组细胞增殖速度更快，凋亡率更低，生长曲线更符合原代细胞的生长规律。这得益于该培养箱的可调O₂浓度功能，通过模拟细胞体内的低氧环境，可激活细胞内的缺氧诱导因子（HIF）信号通路，促进细胞增殖相关基因的表达，同时抑制凋亡相关基因的激活。此外，博清生物三气培养箱采用的抗菌内胆设计和高效空气过滤系统，可有效减少箱内细菌、真菌等污染，降低细胞因污染导致的凋亡，进一步提高细胞培养的稳定性。
维持原代细胞的原始表型和生物学功能是其在科研中应用的核心价值所在。本研究结果显示，博清生物三气培养箱组小鼠BMSCs的间充质干细胞表型纯度更高，大鼠原代肝细胞的白蛋白分泌量和细胞色素P450蛋白表达水平更优。这表明该培养箱提供的生长环境可有效抑制原代细胞的体外分化，维持其原始的生物学功能。传统CO₂培养箱的常氧环境易导致原代细胞发生氧化应激反应，进而引起细胞表型改变和功能衰退，而博清生物三气培养箱通过精准调控O₂浓度，可减少氧化应激对细胞的损伤，为细胞功能维持提供保障。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的三气培养箱通过精准的气体浓度调控、稳定的温湿度控制及优异的抑菌设计，显著提高了原代细胞的贴壁率和增殖活性，降低了细胞凋亡率，更好地维持了细胞的原始表型和生物学功能。该设备为原代细胞培养提供了可靠的体外生长环境，有望在细胞生物学、药理学、再生医学等多个生命科学研究领域得到广泛应用。未来，可进一步探讨该培养箱在不同来源、不同类型原代细胞培养中的应用效果，为其更广泛的推广提供更全面的实验依据。
