博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计是一款集高灵敏度、高稳定性、操作便捷性于一体的新型荧光检测仪器，其采用先进的光学采集系统与信号处理算法，可实现对微弱荧光信号的精准捕捉与定量分析。
一、材料与方法
（一）实验材料
靶蛋白A（分子量约50kDa）、配体蛋白B（分子量约30kDa）由本实验室通过原核表达系统（E. coli BL21）诱导表达并经Ni-NTA亲和层析纯化获得；荧光标记试剂盒（FITC标记试剂盒、TRITC标记试剂盒）；PBS缓冲液（0.01 mol/L, pH 7.4）；超纯水；其他化学试剂均为分析纯。
实验仪器：博清生物荧光计；超低温离心机；蛋白纯化系统；酶标仪；精密电子天平。
（二）实验方法
1、荧光标记蛋白的制备与鉴定
依据荧光标记试剂盒说明书，分别对靶蛋白A与配体蛋白B进行荧光标记：将纯化后的靶蛋白A溶于PBS缓冲液（0.01mol/L, pH 7.4）中，调整蛋白浓度至1mg/mL，加入FITC标记试剂（FITC与蛋白摩尔比为10:1），在4℃避光条件下孵育2h；同时，将配体蛋白B以相同浓度溶于PBS缓冲液中，加入TRITC标记试剂（TRITC与蛋白摩尔比为10:1），4℃避光孵育2h。孵育结束后，采用透析袋（截留分子量3.5kDa）在PBS缓冲液中4℃透析过夜，更换3次透析液以去除未结合的游离荧光素。
通过SDS-PAGE电泳鉴定荧光标记蛋白的纯度，采用酶标仪检测标记后蛋白的荧光强度，计算荧光标记效率（标记效率=（实际标记的荧光素摩尔数/蛋白摩尔数）×100%），确保标记效率在0.8~1.2之间，满足后续实验需求。
2、博清生物荧光计检测参数优化
以FITC标记的靶蛋白A为供体，TRITC标记的配体蛋白B为受体，基于FRET原理设计检测方案。使用博清生物荧光计对检测参数进行优化，包括激发波长、发射波长、狭缝宽度、检测时间等：供体FITC的激发波长设定为488nm，发射波长设定为525nm；受体TRITC的激发波长设定为550nm，发射波长设定为575nm；通过梯度实验确定狭缝宽度为5nm（激发狭缝）/5nm（发射狭缝），检测时间为1s，在此参数下可获得最佳的荧光信号强度与信噪比。
3、蛋白-蛋白相互作用的定性检测
设置实验组与对照组：实验组为FITC-靶蛋白A（终浓度1μmol/L）与TRITC-配体蛋白B（终浓度1μmol/L）的混合体系，溶于PBS缓冲液（0.01mol/L, pH7.4）中，总体积为200μL；对照组1为FITC-靶蛋白A（终浓度1μmol/L）单独体系，对照组2为TRITC-配体蛋白B（终浓度1μmol/L）单独体系，对照组3为FITC（终浓度1μmol/L）与TRITC（终浓度1μmol/L）的混合体系（无蛋白载体）。
将各体系分别加入96孔荧光检测板中，置于博清生物荧光计中，按照优化后的检测参数，分别检测供体发射波长（525nm）下的荧光强度（Fdonor）与受体发射波长（575nm）下的荧光强度（Facceptor）。计算FRET效率（E=FRET/(Fdonor+FRET)），通过比较实验组与各对照组的FRET效率，验证靶蛋白A与配体蛋白B是否存在相互作用。
4、蛋白-蛋白相互作用的亲和力定量分析
固定FITC-靶蛋白A的浓度为1μmol/L，将TRITC-配体蛋白B的浓度梯度设置为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μmol/L，分别与FITC-靶蛋白A混合，制备成系列反应体系，总体积均为200μL。按照优化后的检测参数，使用博清生物荧光计检测各体系的供体荧光强度（Fdonor）与受体荧光强度（Facceptor），计算各浓度下的FRET效率。
以TRITC-配体蛋白B的浓度为横坐标，FRET效率为纵坐标，绘制结合曲线，采用GraphPad Prism 8.0软件进行非线性拟合（拟合模型为单点结合模型），计算靶蛋白A与配体蛋白B相互作用的解离常数（Kd值），定量反映二者的亲和力大小。
5、仪器稳定性与重复性验证
选取实验组中FITC-靶蛋白A与TRITC-配体蛋白B浓度均为1μmol/L的体系，使用博清生物荧光计连续检测10次，记录每次的FRET效率，计算相对标准偏差（RSD），验证仪器的检测稳定性。同时，设置3组平行实验，每组实验重复3次，计算组内与组间RSD，验证实验的重复性。
二、结果与分析
（一）荧光标记蛋白的鉴定结果
SDS-PAGE电泳结果显示，FITC标记的靶蛋白A与TRITC标记的配体蛋白B均呈现单一清晰的条带，分子量分别与预期的50kDa、30kDa一致，表明标记后蛋白纯度良好，未出现降解或杂蛋白污染现象。酶标仪检测结果显示，FITC-靶蛋白A的荧光标记效率为1.02，TRITC-配体蛋白B的荧光标记效率为0.98，均处于0.8~1.2的理想范围内，可用于后续PPIs检测实验。
（二）博清生物荧光计检测参数优化结果
参数优化实验结果表明，当激发波长为488nm（供体）/550nm（受体）、发射波长为525nm（供体）/575nm（受体）、狭缝宽度为5nm/5nm、检测时间为1s时，供体与受体的荧光信号强度达到最大值，且信噪比最高（SNR>50）。此时，仪器对荧光信号的采集灵敏度最佳，可有效避免背景噪声对检测结果的干扰，为后续实验提供了稳定可靠的检测条件。
（三）蛋白-蛋白相互作用的定性检测结果
各实验组与对照组的FRET效率检测结果。实验组的FRET效率为32.6%±1.2%，显著高于对照组1（FITC-靶蛋白A单独体系，FRET效率为2.1%±0.3%）、对照组2（TRITC-配体蛋白B单独体系，FRET效率为1.8%±0.2%）与对照组3（游离FITC与TRITC混合体系，FRET效率为2.3%±0.3%）。这一结果表明，FITC标记的靶蛋白A与TRITC标记的配体蛋白B之间发生了特异性相互作用，导致供体荧光能量向受体转移，使FRET效率显著提升，而对照组中因无蛋白间的特异性结合，未出现明显的FRET效应。
（四）蛋白-蛋白相互作用的亲和力定量分析结果
以TRITC-配体蛋白B的浓度为横坐标，FRET效率为纵坐标绘制的结合曲线。随着TRITC-配体蛋白B浓度的升高，FRET效率逐渐增加，当配体蛋白浓度达到1.0μmol/L时，FRET效率趋于稳定，表明此时FITC-靶蛋白A与TRITC-配体蛋白B的结合达到饱和状态。通过GraphPad Prism 8.0软件进行非线性拟合，计算得出二者相互作用的解离常数Kd值为2.34±0.12μmol/L，表明靶蛋白A与配体蛋白B之间存在中等强度的特异性相互作用，这一结果与已知的该蛋白对相互作用特性相符，验证了博清生物荧光计在PPIs亲和力定量检测中的准确性。
（五）仪器稳定性与重复性验证结果
稳定性实验结果显示，连续10次检测同一体系的FRET效率相对标准偏差（RSD）为1.8%，表明博清生物荧光计具备良好的检测稳定性，可有效避免因仪器波动导致的检测误差。重复性实验结果显示，组内RSD为2.1%，组间RSD为2.5%，均小于3%，表明该检测体系具有优异的重复性，实验结果可靠。
三、讨论
蛋白-蛋白相互作用的精准检测是解析生命活动分子机制与开展药物研发的关键环节。传统PPIs检测技术如酵母双杂交虽可实现高通量筛选，但存在假阳性率高、无法反映蛋白在体内的真实相互作用状态等问题；SPR技术虽可实现实时定量检测，但仪器成本高昂、样本处理复杂，限制了其在常规实验室中的应用。荧光共振能量转移技术结合高灵敏度荧光计，可实现对PPIs的实时、非侵入性检测，且具有样本消耗量低、操作简便等优势，已成为PPIs检测的重要技术手段。
本研究采用博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计构建了荧光标记蛋白-蛋白相互作用检测体系，通过对检测参数的优化，实现了对靶蛋白A与配体蛋白B相互作用的精准检测。实验结果表明，该仪器可有效捕捉FRET过程中的荧光信号变化，成功完成了PPIs的定性验证与亲和力定量分析。与传统荧光计相比，博清生物荧光计具有更高的灵敏度与稳定性，连续检测的RSD仅为1.8%，远低于行业平均水平（通常为3%~5%），这一优势使其能够准确检测低丰度蛋白之间的微弱相互作用。同时，该仪器操作便捷，检测周期短（单一样本检测时间仅为1s），可显著提高实验效率，降低实验成本。
在实验过程中，我们发现荧光标记效率对检测结果具有重要影响，若标记效率过低，会导致荧光信号强度不足，影响FRET效应的检测；若标记效率过高，可能会导致蛋白空间构象改变，影响蛋白间的正常相互作用。因此，在后续实验中，需严格控制荧光标记条件，确保标记效率处于理想范围内。此外，缓冲液的pH值、离子强度等环境因素也可能影响蛋白的稳定性与相互作用，需根据具体实验对象优化反应体系条件。
未来，我们可进一步拓展该检测体系的应用范围，如用于药物对PPIs的调控作用检测，通过检测药物存在下PPIs的亲和力变化，筛选潜在的药物靶点或评估药物活性；同时，可结合流式细胞术、共聚焦显微镜等技术，实现对蛋白-蛋白相互作用的原位检测，更真实地反映其在细胞内的动态变化过程。
本研究成功构建了基于博清生物荧光计的荧光标记蛋白-蛋白相互作用检测体系，该体系可高效、精准地实现对PPIs的定性验证与亲和力定量分析。实验结果表明，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计具有优异的灵敏度、稳定性与重复性，检测效率高、样本消耗量低，在生命科学研究及药物研发领域具有广阔的应用前景。该研究为博清生物荧光计的推广应用提供了坚实的实验依据，也为蛋白-蛋白相互作用检测技术的发展提供了新的思路与方法。
