病原体核酸检测是目前临床诊断感染性疾病的重要手段，其中荧光定量PCR技术因其高灵敏度、高特异度、快速准确等优势，被广泛应用于病毒、细菌等病原体的检测与定量分析。病原体载量阈值的科学判定是该技术应用的核心环节，直接关系到检测结果的准确性和临床诊断的可靠性，其不仅能区分感染与否，还能为病情评估、治疗效果监测提供关键依据。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪作为国产自主研发的检测设备，具有操作便捷、性价比高、适配多种荧光化学体系等特点，在基层医疗机构和大规模筛查中具有广阔的应用前景。然而，目前关于该仪器在不同病原体核酸检测中载量阈值的系统性研究尚较为缺乏，导致其在临床应用中缺乏统一的判定标准，一定程度上限制了仪器的推广与应用。因此，本研究选取临床常见的甲型流感病毒（H1N1）、乙型肝炎病毒（HBV）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）为研究模型，系统探讨博清生物荧光定量PCR仪在病原体核酸定量检测中的载量阈值判定方法，验证其检测性能，为该仪器的临床规范化应用提供实验支撑。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器 博清生物荧光定量PCR仪；对照荧光定量PCR仪；核酸提取仪；超净工作台。
2、试剂与标准品 H1N1、HBV、SARS-CoV-2核酸标准品；病原体核酸提取试剂盒；荧光定量PCR检测试剂盒；无酶纯水。
3、临床样本 收集2024年1月—2024年6月某医院临床疑似感染样本共300例，其中疑似H1N1感染样本100例、疑似HBV感染样本100例、疑似SARS-CoV-2感染样本100例。所有样本均经伦理委员会批准，患者知情同意。
（二）实验方法
1、标准品梯度稀释 取3种病原体的标准品（1×10⁸copies/mL），用无酶纯水进行10倍梯度稀释，制备浓度分别为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/mL的系列标准品，每个浓度设置3个复孔。
2、核酸提取 按照核酸提取试剂盒说明书操作，分别对系列标准品和临床样本进行核酸提取，提取后的核酸样本置于-20℃冰箱保存备用。
3、荧光定量PCR检测 按照荧光定量PCR检测试剂盒说明书配制反应体系（20μL体系：2×PCR Buffer 10μL、上游引物0.8μL、下游引物0.8μL、探针0.4μL、Taq酶0.2μL、模板核酸2μL、无酶纯水5.8μL）。分别在博清生物荧光定量PCR仪和对照荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，共40个循环；收集荧光信号（FAM通道）。
4、阈值初步设定 参考试剂盒说明书推荐的阈值范围，结合博清生物荧光定量PCR仪的基线设置特点（基线范围：3~15个循环），初步设定阈值为基线荧光信号均值的1.5倍，记录各标准品和样本的Ct值。
5、载量阈值确定 以系列标准品的核酸拷贝数（对数转换）为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，分析两者的相关性和扩增效率。将临床样本分别用两种仪器检测，以对照仪器的检测结果为金标准，将样本分为阳性组和阴性组。以博清生物仪器检测的病原体载量为自变量，以样本阴阳性为因变量，绘制ROC曲线，计算曲线下面积（AUC），根据约登指数（灵敏度+特异度-1）最大值确定各病原体的最佳载量阈值。
6、性能验证 采用确定的最佳载量阈值，对3种病原体的系列标准品进行检测，计算检测下限（LOD，以95%置信度能检出的最低浓度）；选取高、中、低3个浓度的标准品进行重复性检测（每个浓度重复10次），计算变异系数（CV）；对100例临床样本进行检测，与金标准结果比较，计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及一致性Kappa值。
二、结果
（一）标准曲线绘制结果
博清生物荧光定量PCR仪检测3种病原体系列标准品的Ct值与核酸拷贝数对数均呈良好的线性关系。其中，H1N1的标准曲线方程为y=-3.42x+40.15，R²=0.996，扩增效率E=96.8%；HBV的标准曲线方程为y=-3.35x+39.82，R²=0.995，扩增效率E=98.5%；SARS-CoV-2的标准曲线方程为y=-3.45x+40.31，R²=0.997，扩增效率E=95.2%。所有标准品的扩增效率均在90%~110%的理想范围内，表明该仪器的扩增性能稳定。
（二）病原体载量阈值确定结果
以对照仪器检测结果为金标准，100例疑似H1N1感染样本中，阳性60例、阴性40例；100例疑似HBV感染样本中，阳性55例、阴性45例；100例疑似SARS-CoV-2感染样本中，阳性62例、阴性38例。绘制博清生物仪器检测载量的ROC曲线，结果显示，H1N1、HBV、SARS-CoV-2的AUC分别为0.982、0.975、0.988，均>0.97，表明该仪器检测结果具有良好的诊断价值。根据约登指数最大值确定各病原体的最佳载量阈值：H1N1为5.2×10²copies/mL（约登指数=0.95），HBV为3.1×10¹copies/mL（约登指数=0.93），SARS-CoV-2为1.8×10²copies/mL（约登指数=0.96）。
（三）性能验证结果
1、检测下限（LOD）采用最佳载量阈值检测系列标准品，H1N1、HBV、SARS-CoV-2的LOD分别为5.2×10¹copies/mL、3.1×10⁰copies/mL、1.8×10¹copies/mL，均低于确定的最佳载量阈值，表明该仪器具有较高的检测灵敏度。
2、重复性 高、中、低3个浓度标准品的重复性检测结果显示，3种病原体的Ct值变异系数（CV）均<3%，表明该仪器的检测重复性良好。
3、临床样本检测一致性 采用最佳载量阈值对100例临床样本进行检测，博清生物仪器与对照仪器检测结果的一致性分析显示，H1N1、HBV、SARS-CoV-2的Kappa值分别为0.93、0.90、0.95，均>0.85，表明两种仪器的检测结果具有高度一致性。
三、讨论
荧光定量PCR技术的核心是通过Ct值与病原体核酸拷贝数的线性关系实现定量检测，而载量阈值的判定直接决定了检测结果的阴阳性判定，是临床诊断的关键依据。不同仪器的光学系统、基线设置、荧光信号采集效率存在差异，导致同一病原体在不同仪器上的最佳载量阈值可能不同，因此需要针对特定仪器建立专属的阈值判定标准。
本研究选取博清生物荧光定量PCR仪为研究对象，以3种临床常见病原体为模型，通过系列标准品梯度稀释绘制标准曲线，结果显示该仪器检测3种病原体的Ct值与核酸拷贝数均呈良好的线性关系（R²均>0.99），扩增效率在90%~110%之间，表明该仪器的扩增性能稳定，能够满足病原体核酸定量检测的基本要求。进一步通过ROC曲线分析确定各病原体的最佳载量阈值，其中H1N1为5.2×10²copies/mL、HBV为3.1×10¹copies/mL、SARS-CoV-2为1.8×10²copies/mL，此时检测的灵敏度和特异度均>95%，表明该阈值具有良好的诊断价值。
性能验证结果显示，该仪器检测3种病原体的LOD均低于最佳载量阈值，说明其具有较高的检测灵敏度，能够检出低浓度的病原体核酸；重复性检测中，高、中、低3个浓度标准品的Ct值CV均<3%，表明仪器的检测重复性良好，结果稳定可靠；与国际公认的对照仪器检测结果相比，两种仪器的一致性Kappa值均>0.85，具有高度一致性，进一步验证了博清生物荧光定量PCR仪的检测性能。
需要注意的是，本研究仅选取了3种常见病原体，且临床样本来源单一，后续还需扩大病原体种类和样本量，进一步验证该阈值判定标准的通用性和适用性。此外，样本的采集、运输、核酸提取过程也可能影响检测结果，临床应用中还需严格规范实验操作流程，以确保检测结果的准确性。
综上所述，本研究建立的博清生物荧光定量PCR仪针对H1N1、HBV、SARS-CoV-2的载量阈值判定标准具有良好的灵敏度和特异度，该仪器在病原体核酸定量检测中性能稳定可靠，可满足临床诊断需求，为国产荧光定量PCR仪的临床规范化应用提供了实验依据。
