博清生物科技（南京）有限公司研发的核酸提取仪是一款基于磁珠法的自动化核酸提取设备，采用特异性磁珠吸附核酸，可实现对不同类型样本中核酸的高效提取。本研究旨在探讨该核酸提取仪在细菌、真菌感染核酸检测中的应用效果，通过与传统手工酚-氯仿法进行对比，分析其在核酸提取效率、纯度、检测阳性率及操作耗时等方面的优势，为其在临床感染性疾病诊断中的推广应用提供实验依据。
一、材料与方法
（一）实验样本
选取疑似细菌或真菌感染患者的临床样本共210份，包括痰液65份、血液50份、脑脊液25份、尿液40份、脓液30份。样本采集后均在2h内送至实验室进行处理，若不能及时处理则置于-20℃冰箱冷藏保存。
（二）实验仪器与试剂
1、仪器：博清生物核酸提取仪、实时荧光定量PCR仪、紫外分光光度计、高速冷冻离心机。
2、试剂：磁珠法核酸提取试剂盒、传统酚-氯仿核酸提取试剂、细菌及真菌特异性qPCR检测试剂盒、DNA Marker。
（三）实验方法
1、核酸提取
将210份样本均分为两组，每组105份，分别采用博清生物核酸提取仪和传统手工酚-氯仿法进行核酸提取。
博清生物核酸提取仪提取流程：严格按照博清生物磁珠法核酸提取试剂盒说明书操作，取适量样本（痰液、脓液样本需先进行液化处理，血液样本需先进行红细胞裂解）加入提取管中，再加入裂解液、磁珠悬液，置于博清生物核酸提取仪上，选择对应的提取程序（样本类型不同，提取程序略有差异，总体包括裂解、结合、洗涤、洗脱4个步骤），最终洗脱得到核酸样本，置于-20℃保存备用。
传统手工酚-氯仿法提取流程：取适量样本进行预处理后，加入裂解液充分裂解，然后加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），充分振荡混匀后，12000r/min离心10min，吸取上层水相至新的离心管中，重复酚-氯仿-异戊醇抽提2次；加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），振荡混匀后，12000r/min离心10min，吸取上层水相；加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc溶液，-20℃静置30min，12000r/min离心15min，弃去上清液；用75%乙醇洗涤沉淀2次，晾干后加入适量TE缓冲液溶解沉淀，得到核酸样本，置于-20℃保存备用。
2、核酸纯度与浓度检测
采用紫外分光光度计检测两种方法提取的核酸样本的A260/A280比值和核酸浓度。A260/A280比值在1.8~2.0之间表示核酸纯度较好，无明显蛋白质污染；记录每份样本的核酸浓度，计算平均值。
3、qPCR检测
以两种方法提取的核酸为模板，采用对应的细菌、真菌特异性qPCR检测试剂盒进行检测，严格按照试剂盒说明书设置反应体系和反应条件。反应体系为25μL，包括2×qPCR Mix 12.5μL、上游引物（10μmol/L）1μL、下游引物（10μmol/L）1μL、探针（10μmol/L）0.5μL、模板核酸2μL、无酶水8μL。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，共40个循环。以Ct值≤35且溶解曲线为单一峰判定为阳性，Ct值>35或无扩增曲线判定为阴性。
4、操作耗时统计
记录两种方法提取单批次24份样本的总操作时间（从样本预处理完成后开始，至核酸提取完成止），每组重复检测3次，计算平均耗时。
二、结果
（一）两种方法提取核酸的纯度与浓度比较
博清生物核酸提取仪提取的核酸样本A260/A280比值为1.78~1.89，平均为1.83±0.05；传统手工酚-氯仿法提取的核酸样本A260/A280比值为1.62~1.75，平均为1.68±0.07。博清生物核酸提取仪提取的核酸纯度显著高于传统手工法，差异有统计学意义（t=12.36，P<0.05）。
博清生物核酸提取仪提取的核酸浓度平均为（86.32±12.45）ng/μL；传统手工法提取的核酸浓度平均为（62.15±10.83）ng/μL。博清生物核酸提取仪提取的核酸浓度显著高于传统手工法，差异有统计学意义（t=9.87，P<0.05）。
（二）两种方法提取核酸的qPCR检测阳性率比较
在105份采用博清生物核酸提取仪提取的样本中，检测出细菌感染阳性41份，阳性率为39.05%；真菌感染阳性20份，阳性率为19.05%；总阳性61份，总阳性率为58.10%。
在105份采用传统手工酚-氯仿法提取的样本中，检测出细菌感染阳性33份，阳性率为31.43%；真菌感染阳性14份，阳性率为13.33%；总阳性47份，总阳性率为44.76%。
博清生物核酸提取仪检测的细菌感染阳性率、真菌感染阳性率及总阳性率均高于传统手工法，其中总阳性率差异有统计学意义（χ²=4.28，P<0.05）。具体数据见表2。
（三）两种方法操作耗时比较
博清生物核酸提取仪单批次24份样本操作耗时平均为45±5min；传统手工酚-氯仿法单批次24份样本操作耗时平均为120±15min。博清生物核酸提取仪操作耗时显著短于传统手工法，差异有统计学意义（t=23.51，P<0.05）。
三、讨论
感染性疾病的快速精准诊断是临床治疗的关键，而核酸检测技术是实现这一目标的重要手段，其中核酸提取环节的质量直接决定了后续检测结果的准确性。传统的手工酚-氯仿法虽然成本较低，但操作步骤繁琐，需要多次离心、抽提，耗时较长，且容易受到人为操作误差的影响，导致核酸提取纯度和效率较低，尤其是对于一些微量样本或复杂样本，往往难以获得理想的提取效果。
本研究采用博清生物核酸提取仪与传统手工酚-氯仿法进行对比，结果显示博清生物核酸提取仪提取的核酸样本A260/A280比值平均为1.83±0.05，显著高于传统手工法的1.68±0.07，说明其提取的核酸纯度更高，蛋白质污染更少。这主要是因为博清生物核酸提取仪采用磁珠法提取原理，磁珠表面修饰有特异性基团，可与核酸特异性结合，而蛋白质等杂质则不会与磁珠结合，通过洗涤步骤可有效去除杂质，从而提高核酸纯度。同时，博清生物核酸提取仪提取的核酸浓度平均为（86.32±12.45）ng/μL，也显著高于传统手工法，表明其核酸提取效率更高，能够从样本中更充分地释放和回收核酸，这对于微量病原微生物感染的检测尤为重要。
在qPCR检测阳性率方面，博清生物核酸提取仪检测的总阳性率为58.10%，显著高于传统手工法的44.76%，其中细菌感染和真菌感染阳性率也均高于传统手工法，虽然细菌和真菌感染阳性率的组间差异未达到统计学意义，但也呈现出明显的优势趋势。这可能是因为博清生物核酸提取仪提取的核酸纯度和浓度更高，减少了PCR抑制物的干扰，从而提高了qPCR检测的灵敏度，能够检测到样本中低浓度的病原微生物核酸。例如，在一些临床疑似感染但传统方法检测为阴性的样本中，采用博清生物核酸提取仪提取核酸后，qPCR检测出现了阳性结果，这为临床疑难感染病例的诊断提供了重要线索。
在操作耗时方面，博清生物核酸提取仪单批次24份样本操作耗时平均仅为45±5min，远短于传统手工法的120±15min。这是因为博清生物核酸提取仪实现了自动化操作，无需人工进行多次离心、抽提等繁琐步骤，只需将样本和试剂加入提取管中，设置好程序后即可自动完成提取过程，不仅大大缩短了操作时间，还减少了人为操作误差，提高了实验的重复性和稳定性。此外，博清生物科技（南京）有限公司研发的核酸提取仪还具有样本适应性广的特点，可用于痰液、血液、脑脊液、尿液等多种类型样本的核酸提取，无需进行复杂的样本预处理，进一步提高了临床检测的效率。
本研究也存在一定的局限性，例如样本量相对有限，且未对不同浓度病原微生物样本的提取效果进行分层分析。在后续研究中，将扩大样本量，进一步探讨博清生物核酸提取仪在不同浓度、不同类型病原微生物感染样本中的应用效果，同时结合临床治疗结果，评估其对临床诊疗决策的指导价值。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的核酸提取仪在细菌、真菌感染的核酸检测中具有核酸提取效率高、纯度好、检测阳性率高及操作快捷等显著优势，能够满足临床感染性疾病快速精准诊断的需求，具有较高的临床推广应用价值。
