博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪作为国产自主研发的仪器，在光学设计、温控技术等方面进行了优化升级。本研究旨在系统评价该仪器在细菌与真菌核酸定量检测中的性能，包括线性关系、灵敏度、特异性、重复性，并通过临床样本检测验证其应用价值，为临床推广应用提供实验依据。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、仪器：博清生物荧光定量PCR仪；传统PCR仪；核酸提取仪；超净工作台；恒温培养箱。
2、试剂与菌株
细菌和真菌基因组DNA提取试剂盒；荧光定量PCR反应试剂盒；各病原体引物序列参考GenBank数据库保守序列设计；金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、肺炎链球菌（ATCC 49619）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、结核分枝杆菌（H37Rv）、白色念珠菌（ATCC 10231）、光滑念珠菌（ATCC 15126）、曲霉菌（ATCC 16404）、隐球菌（ATCC 32609）标准菌株均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；120份临床疑似感染样本（包括痰液、血液、尿液、脑脊液）。
3、标准质粒构建
采用基因组DNA提取试剂盒提取各标准菌株的基因组DNA，以其为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增，获得各病原体的目的基因片段。将目的基因片段克隆至pMD19-T载体（TaKaRa公司），转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，经筛选、鉴定后获得阳性重组质粒。采用质粒提取试剂盒提取重组质粒，通过核酸定量仪测定质粒浓度，根据质粒分子量计算拷贝数，构建各病原体的标准质粒。
（二）实验方法
1、标准曲线绘制
将各病原体的标准质粒进行10倍梯度稀释，稀释浓度范围为10⁶-10¹copies/μL（细菌）和10⁷-10²copies/μL（真菌）。以稀释后的标准质粒为模板，采用博清生物荧光定量PCR仪进行检测。PCR反应体系为20μL：包括SYBR Green Ⅰ混合液10μL、上游引物（10μmol/L）0.8μL、下游引物（10μmol/L）0.8μL、模板DNA 2μL、无酶水6.4μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共40个循环；熔解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。每个稀释度设置3个复孔，以循环阈值（Ct值）为纵坐标，标准质粒拷贝数的对数为横坐标，绘制标准曲线，计算相关系数（R²）。
2、灵敏度检测
将各病原体的标准质粒进一步梯度稀释，细菌稀释至10⁰-10⁶copies/μL，真菌稀释至10¹-10⁷copies/μL。采用博清生物荧光定量PCR仪进行检测，每个稀释度设置3个复孔，以能稳定检测到阳性信号的最低拷贝数作为该仪器对该病原体的检测灵敏度。
3、特异性检测
以各标准菌株的基因组DNA为模板，分别使用其他病原体的特异性引物进行荧光定量PCR检测，同时设置无模板对照（NTC）。若仅在对应病原体的模板与引物组合中出现特异性熔解曲线和阳性Ct值，其他组合及NTC均无阳性信号，则表明该仪器检测具有良好的特异性。
4、重复性检测
选取各病原体标准质粒的中浓度稀释液（细菌10⁴copies/μL，真菌10⁵copies/μL），采用博清生物荧光定量PCR仪进行检测，同一批次设置6个复孔，连续检测3个批次。计算各批次内及批次间的Ct值变异系数（CV），CV＜3%表明重复性良好。
5、临床样本检测
采用核酸提取试剂盒提取120份临床疑似感染样本的基因组DNA，分别使用博清生物荧光定量PCR仪和传统培养法进行检测。传统培养法按照《临床微生物学检验操作规程》进行菌株分离、培养和鉴定。对比两种方法的检测阳性率，计算荧光定量PCR仪的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。
二、结果
（一）标准曲线绘制结果
博清生物荧光定量PCR仪对5种细菌和4种真菌标准质粒的检测均呈现良好的线性关系。其中，细菌标准曲线的相关系数（R²）均≥0.996，斜率范围为-3.302~-3.415；真菌标准曲线的相关系数（R²）均≥0.995，斜率范围为-3.285~-3.398，均符合荧光定量PCR技术对线性关系的要求。
（二）灵敏度检测结果
灵敏度检测结果显示，博清生物荧光定量PCR仪对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌的最低检测限均为10¹copies/μL；对白色念珠菌、光滑念珠菌、曲霉菌、隐球菌的最低检测限均为10²copies/μL。在最低检测限浓度下，3个复孔均能稳定检测到阳性信号，且熔解曲线单一，无杂峰。
（三）特异性检测结果
特异性检测结果显示，仅在各病原体的模板与对应特异性引物组合中检测到阳性信号，出现特异性熔解曲线；使用其他病原体的引物进行检测时，均未出现阳性信号，无模板对照也无阳性扩增。表明博清生物荧光定量PCR仪对细菌和真菌的检测具有良好的特异性，无交叉反应。
（四）重复性检测结果
重复性检测结果显示，各病原体标准质粒中浓度稀释液的批次内Ct值变异系数（CV）为1.23%~2.45%，批次间Ct值变异系数（CV）为1.56%~2.78%，均＜3%。表明博清生物荧光定量PCR仪的检测重复性良好。
（五）临床样本检测结果
120份临床疑似感染样本中，博清生物荧光定量PCR仪共检测出阳性样本70份，阳性率为58.3%；其中细菌阳性51份（42.5%），真菌阳性19份（15.8%）。传统培养法共检测出阳性样本55份，阳性率为45.8%；其中细菌阳性42份（35.0%），真菌阳性13份（10.8%）。博清生物荧光定量PCR仪对细菌和真菌的检出率均显著高于传统培养法（χ²=4.321、4.032，P均＜0.05）。以传统培养法为参照，博清生物荧光定量PCR仪检测细菌的敏感性为95.2%、特异性为89.3%、阳性预测值为78.4%、阴性预测值为97.8%；检测真菌的敏感性为92.3%、特异性为94.5%、阳性预测值为65.8%、阴性预测值为98.9%。此外，博清生物荧光定量PCR仪的检测时间仅为3-4h，远短于传统培养法的24-72h。
三、讨论
感染性疾病的早期诊断是改善患者预后的关键，而病原体的快速定量检测是实现早期诊断的核心。荧光定量PCR技术凭借其高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，已成为病原体检测的重要手段，而仪器的性能直接决定了检测结果的可靠性。本研究针对博清生物荧光定量PCR仪在细菌与真菌核酸定量检测中的性能进行了系统评价，结果表明该仪器具有优异的检测性能。
线性关系是荧光定量PCR仪进行准确定量的基础，相关系数R²越接近1，表明定量准确性越高。本研究中，博清生物荧光定量PCR仪对5种细菌和4种真菌标准质粒的检测均呈现良好的线性关系，R²均≥0.995，斜率范围符合理想荧光定量PCR反应的要求，表明该仪器具备准确量化病原体核酸的能力。灵敏度方面，该仪器对细菌的检测灵敏度可达10¹copies/μL，对真菌的检测灵敏度可达10²copies/μL，显著高于传统培养法，能够检测到低浓度的病原体核酸，可满足临床早期感染样本检测的需求，尤其适用于病原体载量较低的样本（如早期感染患者的血液、脑脊液样本）。
特异性是避免误诊的关键，本研究通过交叉反应实验验证了博清生物荧光定量PCR仪的特异性，结果显示该仪器对各病原体的检测均无交叉反应，仅能特异性扩增对应病原体的目的基因，这得益于其优化的光学系统和荧光信号采集技术，能够有效区分特异性荧光信号和非特异性荧光信号。重复性实验结果显示，该仪器的批次内和批次间CV均＜3%，表明其检测结果稳定可靠，能够为临床提供一致的检测数据，为治疗效果的动态监测提供有力支持。
在临床样本检测中，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪对细菌和真菌的检出率均显著高于传统培养法，这是因为传统培养法受病原体培养条件、样本中抑制剂等因素影响，部分病原体难以分离培养，而荧光定量PCR技术直接针对病原体核酸进行检测，不受培养条件限制。同时，该仪器的检测时间仅为3-4h，远短于传统培养法的24-72h，能够快速为临床提供检测结果，帮助医生及时调整治疗方案，避免滥用抗生素，减少耐药菌株的产生。此外，该仪器操作简便，自动化程度高，可有效降低人为操作误差，适合在临床实验室广泛推广应用。
本研究也存在一定的局限性：首先，研究选取的病原体种类有限，未来需扩大病原体检测范围，进一步验证该仪器的性能；其次，临床样本数量相对较少，需增加样本量进行多中心研究，以提高研究结果的普遍性。
综上所述，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪在细菌与真菌核酸定量检测中具有线性关系好、灵敏度高、特异性强、重复性佳及检测快速等优势，能够满足临床病原体快速定量检测的需求，为感染性疾病的早期诊断、精准治疗和预后评估提供重要的技术支持，具有广阔的临床应用前景。
