一、研究背景
制药与生物技术产业中，生物反应器的发酵过程是一个复杂的动态系统，细胞生长、代谢及目的产物合成受温度、pH、溶解氧（DO）、营养物质浓度等多重因素调控。传统监测方法（如离线取样结合HPLC、细胞计数板）存在检测周期长、样本消耗量高、操作繁琐等缺陷，难以实时反映发酵体系的动态变化，易导致工艺参数失控，影响产品收率与质量一致性。因此，开发高通量、快速、精准的监测技术成为产业迫切需求。
酶标仪作为基于抗原-抗体特异性结合、酶促反应显色原理的分析仪器，具有检测速度快、样本需求量少、自动化程度高等优势，已广泛应用于生命科学研究。博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪在传统酶标仪基础上优化了光学系统与检测算法，具备微孔板高通量分析及数据实时导出功能，但其在生物反应器工业级监测中的系统性应用研究尚未见报道。
二、材料与方法
（一）实验仪器与试剂
1、核心仪器：博清生物酶标仪；对照仪器：自动细胞计数仪。
2、试剂：细胞密度检测试剂盒、葡萄糖/乳酸检测试剂盒、谷氨酰胺/谷氨酸检测试剂盒、单克隆抗体检测试剂盒；CHO-K1细胞、DMEM高糖培养基、胎牛血清；发酵液常见杂质。
（二）实验设计
1、检测方法建立
细胞密度（CD）：采用MTT法，取发酵液样本10μL，与90μL MTT工作液混合，37℃孵育4h后，酶标仪检测570nm处吸光度（OD570），建立OD值与细胞浓度的标准曲线。
代谢产物（Glc、Lac、Gln、Glu）：按照试剂盒说明书操作，分别检测505nm（Glc）、570nm（Lac）、340nm（Gln/Glu）处吸光度，结合标准曲线计算浓度。
目的蛋白（抗PD-1单抗）：采用间接ELISA法，包被抗原（PD-1蛋白），加入稀释后的发酵液样本，二抗标记HRP，TMB显色后检测450nm处吸光度，定量蛋白浓度。
2、方法学验证
线性范围：配制系列浓度标准品（CD：1×10³~1×10⁷cells/mL；Glc：0~50mmol/L；Lac：0~30mmol/L；Gln：0~10mmol/L；Glu：0~5mmol/L；单抗：0~100μg/mL），检测吸光度并进行线性回归分析。
精密度：同一批次样本重复检测6次（批内精密度），连续3天检测同一批次样本（批间精密度），计算变异系数（CV）。
准确度：向已知浓度的发酵液样本中加入不同比例标准品，计算回收率。
特异性：向样本中加入发酵液常见杂质（终浓度：蔗糖50g/L、甘油20g/L、吐温80 1 g/L），检测吸光度变化率。
3、实际发酵工艺监测
采用CHO-K1细胞表达抗PD-1单抗，5L生物反应器发酵14天，分别于0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288h取样，使用博清生物酶标仪与对照仪器同步检测各指标，对比检测结果一致性及动态变化趋势。
三、结果与分析
（一）方法学验证结果
1、线性范围
博清生物酶标仪检测各指标的线性范围及相关系数显示，所有指标的R²均≥0.995，表明标准曲线线性关系良好，可覆盖生物反应器发酵过程中各指标的浓度变化范围。
2、精密度与准确度
批内与批间精密度结果显示，各指标CV值均≤3.2%，表明仪器检测重复性良好；回收率在95.8%~103.6%之间，符合生物检测方法的准确度要求（回收率 90%~110%）。
3、特异性
添加发酵液常见杂质后，各指标吸光度变化率均≤2.5%，表明博清生物酶标仪检测不受杂质干扰，特异性良好。
（二）实际发酵工艺监测结果
1、检测结果一致性
博清生物酶标仪与对照仪器（细胞计数仪、HPLC）检测结果的相关性分析显示，各指标的相关系数均≥0.990，表明两种方法检测结果高度一致，博清生物酶标仪可替代传统方法用于实际发酵监测。
2、发酵过程动态监测
CHO-K1细胞发酵14天的动态监测结果显示：细胞密度在0~72h快速增长，72h达到峰值（8.6×10⁶cells/mL），随后进入稳定期；葡萄糖浓度随细胞生长持续下降，72h后降至5mmol/L以下；乳酸浓度在48h达到峰值（22.3mmol/L），随后缓慢下降；谷氨酰胺浓度在96h耗尽，谷氨酸浓度同步升高；抗PD-1单抗浓度在72h后开始显著上升，288h达到最高值（89.6 μg/mL）。博清生物酶标仪可实时捕捉上述动态变化，为工艺参数调整（如补料时机、DO调控）提供精准数据支持。
3、检测效率对比
与传统方法相比，博清生物酶标仪的检测效率显著提升：单样本检测时间从HPLC的30~60min、细胞计数仪的10min 缩短至5min以内；96孔板高通量检测可同时处理80个以上样本，单日检测量提升40%；样本消耗量从HPLC的500μL、细胞计数仪的20μL减少至10μL，样本损耗降低80%。
四、讨论
生物反应器监测的核心需求是“实时、精准、高效”，这直接影响发酵工艺的稳定性与产品质量。本研究中，博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪通过优化的光学系统与特异性检测试剂盒，实现了细胞密度、代谢产物及目的蛋白的一体化监测，其方法学验证结果符合生物检测标准，表明仪器具备工业级应用的可靠性。
与传统方法相比，博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪的核心优势体现在三方面：（1）高通量与低成本：96孔板设计适配规模化生产的批量检测需求，样本消耗量减少80%，降低试剂成本与废液处理压力；（2）实时性与便捷性：检测周期缩短至5min以内，数据可实时导出至工艺控制系统，支持动态调整补料策略与环境参数，减少工艺波动；（3）特异性与抗干扰能力：针对发酵液复杂基质优化的检测方法，可有效规避蔗糖、甘油等杂质的干扰，保障检测准确性。
在实际发酵监测中，博清生物酶标仪成功捕捉了CHO-K1细胞生长、代谢及单抗合成的动态规律：72h细胞密度峰值与葡萄糖耗尽时机的同步性，提示需在48~72h进行葡萄糖补料；乳酸浓度在48h后的下降趋势，反映细胞代谢模式从糖酵解向氧化磷酸化转变；谷氨酰胺耗尽与谷氨酸积累的相关性，为谷氨酰胺补料策略提供依据。这些数据验证了仪器在工艺优化中的实用价值，可帮助企业提升产品收率与质量一致性。
本研究的局限性在于未探究极端发酵条件（如高盐、高黏度发酵液）对检测结果的影响，未来可进一步拓展仪器在特殊工艺（如连续流发酵、固态发酵）中的应用研究；同时，结合物联网技术实现酶标仪与生物反应器的在线联动，构建智能化监测系统，将是后续研究的重点方向。
本研究建立了博清生物酶标仪检测生物反应器关键指标的标准化方法，通过方法学验证与实际发酵工艺监测，证实该仪器具有线性范围宽、精密度高、准确度好、特异性强及检测效率高等优势，可有效替代传统检测方法用于细胞密度、代谢产物及目的蛋白的实时监测。博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪的应用不仅降低了制药与生物技术产业的监测成本，提升了工艺控制精度，还为发酵过程的智能化升级提供了核心技术工具，具有重要的产业应用价值与推广前景。
