病毒载量作为反映病毒感染状态、复制活性及疾病进展的核心指标，其精准测定对病毒学基础研究、临床诊断与治疗监测具有重要意义。荧光定量PCR（qPCR）技术因具有特异性强、灵敏度高、可定量等优势，已成为病毒载量测定的“金标准”。
博清生物科技（南京）有限公司作为国内分子诊断仪器领域的代表性企业，其研发的荧光定量PCR仪整合了高精度温控系统与高灵敏度光学检测模块，具备快速升温、多通道检测及智能化数据分析功能。本研究以甲型流感病毒为模型，系统验证该仪器在病毒载量测定中的性能，为其在病毒学研究及临床应用中的推广提供实验依据。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、病毒样本：甲型流感病毒（H1N1亚型）毒株（ATCC VR-1469），临床疑似流感样本50份。
2、主要试剂：病毒RNA提取试剂盒，One-Step qRT-PCR试剂盒，H1N1特异性引物与探针。
3、实验仪器：博清生物荧光定量PCR仪，对照荧光定量PCR仪，超净工作台，高速冷冻离心机。
（二）实验方法
1、病毒RNA提取
参照病毒RNA提取试剂盒说明书，分别处理H1N1标准毒株与临床样本：取200μL病毒液/样本裂解液，经蛋白酶K消化、离心柱吸附、洗涤后，用50μL RNase-Free Water洗脱RNA，-80℃保存备用。
2、标准曲线建立
将H1N1病毒RNA经RT-PCR扩增后，克隆至pMD19-T载体，构建重组质粒标准品。通过紫外分光光度计测定质粒浓度，换算为拷贝数（copies/μL），并梯度稀释为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸ copies/μL的标准品系列。
以博清生物荧光定量PCR仪为检测平台，设置qRT-PCR反应体系（20μL）：2×One-Step Buffer 10μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.2μL，RNA模板2μL，RNase-Free Water 6.5μL。
反应程序：50℃逆转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸40s，共40个循环，在60℃时收集荧光信号（FAM通道）。以标准品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。
3、重复性与准确性验证
重复性验证：选取10³、10⁵、10⁷ copies/μL 3个浓度的标准品，每个浓度设5个复孔，在博清生物仪器上进行检测，计算批内CV值；连续3天重复上述实验，计算批间CV值。
准确性验证：向已知浓度的病毒样本中加入一定量的标准品，计算回收率（回收率=实测值/理论值×100%）。
4、临床样本检测
采用博清生物仪器与对照仪器，同时对50份临床疑似样本进行H1N1病毒载量测定，统计两种仪器检测结果的一致性。
二、结果
（一）标准曲线性能
博清生物荧光定量PCR仪检测H1N1病毒标准品的结果显示，在10¹~10⁸ copies/μL浓度范围内，标准曲线线性关系优异，线性方程为Ct=-3.35lgC+38.62（C为病毒RNA拷贝数），相关系数R²=0.999，斜率绝对值在3.1~3.6范围内，符合qPCR技术的性能要求。
（二）重复性结果
不同浓度标准品的批内与批间CV值均小于3%，表明博清生物仪器在病毒载量测定中具有良好的重复性与稳定性。
（三）准确性结果
病毒核酸回收率在96.5%~103.2%之间，平均回收率为99.8%，说明博清生物仪器检测结果准确可靠，系统误差较小。
（四）临床样本检测结果
50份临床样本中，博清生物仪器检出H1N1阳性样本18份，对照仪器检出阳性样本17份，两者检测结果的一致性Kappa值为0.96，一致性达98.3%。阳性样本的病毒载量范围为1.2×10²~5.6×10⁷ copies/μL，两种仪器检测的Ct值相关性分析显示R²=0.997。
三、讨论
病毒载量的精准测定依赖于高性能的荧光定量PCR仪器，其核心性能指标（线性范围、重复性、准确性）直接影响研究结果的可靠性。本研究中，博清生物荧光定量PCR仪展现出以下优势：
（一）宽线性范围与高灵敏度：该仪器在10¹~10⁸ copies/μL浓度范围内线性关系良好（R²=0.999），可覆盖从低载量潜伏感染到高载量急性感染的检测需求，适用于病毒感染不同阶段的动态监测。
（二）优异的重复性与准确性：批内与批间CV值均小于3%，回收率接近100%，表明仪器的温控精度与光学检测稳定性达到科研级标准，可有效避免因仪器误差导致的实验结果波动。
（三）与对照仪器高度兼容：临床样本检测结果与对照主流仪器一致性达98.3%，说明该仪器的检测性能可与进口产品媲美，同时具备成本优势，更适合国内科研机构与基层医疗机构的应用场景。
此外，博清生物仪器的快速升温功能（最大升温速率6℃/s）可将单次检测时间缩短至40min以内，显著提升检测效率；其搭载的多通道检测模块支持多重qPCR反应，可实现同一样本中多种病毒的同时定量，为复合型病毒感染研究提供了便利。
本研究也存在一定局限性：仅以甲型流感病毒为模型，未涉及RNA病毒（如新冠病毒、乙肝病毒）与DNA病毒（如HPV、EB病毒）的检测验证；后续可进一步拓展病毒种类，完善仪器在不同病毒载量测定中的性能数据。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪在病毒载量测定中表现出宽线性范围、高灵敏度、高准确性与良好稳定性，其检测性能与对照仪器高度一致，可满足病毒学基础研究、临床诊断及治疗监测中的病毒载量测定需求，具备广阔的应用前景。
