种子作为农业生产的“芯片”，其纯度直接决定作物群体的一致性、抗逆性及最终产量。据《中华人民共和国种子法》规定，主要农作物种子纯度需达到96%以上（常规种）或98%以上（杂交种），但生产中因机械混杂、生物学混杂等问题，杂质种子混入常导致纯度不达标，每年给我国农业造成数十亿元经济损失。因此，建立高效、精准的种子纯度鉴定技术，是保障种业安全与农业高质量发展的核心需求。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、种子样品
水稻品种“南粳46”（纯合样品，纯度99.9%）及杂质种子（“南粳5055”）；
玉米品种“郑单958”（纯合样品，纯度99.9%）及杂质种子（“先玉335”）；
2、主要仪器
荧光定量PCR仪；纳米滴分光光度计；高速离心机；超净工作台。
（二）实验方法
1、种子基因组DNA提取
取单粒种子，去壳后研磨成粉末，称取10mg粉末加入200μL裂解液（试剂盒配套），65℃水浴30min；
加入200μL氯仿，涡旋混匀后12000rpm离心10min，取上清液；
按试剂盒说明书加入吸附柱、洗涤液，最终用50μL洗脱液洗脱DNA；
用纳米滴分光光度计检测DNA纯度，1%琼脂糖电泳验证DNA完整性。
2、特异性验证
分别以“南粳46”、“南粳5055”、“郑单958”、“先玉335”的基因组DNA为模板，采用优化的qPCR体系进行扩增，通过熔解曲线（单一峰为特异性扩增）和荧光信号值（非目标品种无荧光信号）验证引物探针的特异性。
3、标准曲线构建与灵敏度分析
制备“南粳46”杂质梯度样品：将“南粳5055”（杂质）与“南粳46”（纯合）种子按质量比混合，制备杂质含量为0.1%、0.5%、1%、5%、10%的样品，每个梯度3次重复；
提取各梯度样品的混合DNA（每个样品提取3次，取平均值）；
以各梯度DNA为模板进行qPCR扩增，记录Ct值，以杂质含量的对数（lgC）为横坐标，Ct值为纵坐标，构建标准曲线，计算扩增效率；
4、实际样品纯度检测与准确性验证
随机选取3批“南粳46”商品种子和3批“郑单958”商品种子；
每批样品随机取100粒种子，提取混合DNA，采用荧光定量PCR仪进行qPCR检测，根据标准曲线计算纯度；
同时采用传统SSR-PCR电泳法进行纯度检测，以电泳法结果为对照，计算qPCR检测结果的相对偏差。
5、稳定性与重复性验证
批内重复性：选取“南粳46”1% 杂质样品，在同一批次实验中进行8次平行qPCR扩增，计算Ct值的变异系数；
批间重复性：同一“南粳46”1% 杂质样品，在3个不同日期（间隔7d）进行qPCR扩增，每次3次重复，计算总CV值。
二、结果与分析
（一）DNA提取质量
所有种子样品的DNA提取结果显示，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.82-1.95之间，琼脂糖电泳呈现单一明亮条带（无弥散），表明DNA纯度与完整性符合qPCR实验要求，无抑制剂残留影响扩增效率。
（二）特异性验证结果
熔解曲线分析显示，仅“南粳46”模板在60℃左右出现单一特异性峰，“南粳5055”、“郑单958”、“先玉335”模板均无明显荧光峰（荧光信号值<100）；荧光信号图显示，非目标品种的Ct值均大于38（视为阴性），证明引物探针特异性良好，无交叉反应，可准确区分目标品种与杂质品种。
（三）标准曲线与灵敏度
以“南粳46”杂质梯度样品构建的标准曲线，其线性回归方程为Ct=-3.42lgC+35.68，相关系数R²=0.998，扩增效率E=96.5%（符合90%-110%标准）。灵敏度分析显示，杂质含量为0.1%的样品仍可稳定检出（Ct=34.2±0.5），且3次重复的CV=1.4%，表明荧光定量PCR仪的最低检测限可达0.1%，显著优于传统PCR-电泳法（检测限>1%）。
（四）实际样品检测准确性
6批商品种子的纯度检测结果。博清生物荧光定量PCR仪检测结果与传统SSR电泳法结果的相对偏差均小于5%（范围1.2%-4.8%），且检测周期由电泳法的2-3d缩短至4-6h，显著提升了检测效率。
（五）稳定性与重复性
批内重复性实验中，8次平行扩增的Ct值为28.6±0.4，CV=1.4%；批间重复性实验中，3个批次的Ct值分别为28.5±0.3、28.7±0.5、28.4±0.4，总 CV=0.9%。两者CV值均小于3%，表明博清生物荧光定量PCR仪的检测稳定性良好，重复性优异，可满足批量样品的标准化检测需求。
三、讨论
（一）博清荧光定量PCR仪在种子纯度鉴定中的核心优势
本研究证实，博清生物荧光定量PCR仪在农业种子纯度鉴定中具有三大核心优势：
1、高精准性：基于特异性SSR探针与多通道检测，可有效区分近缘品种（如水稻“南粳46”与“南粳5055”），检测限低至0.1%，可捕获极低比例的杂质种子，避免传统方法的漏检问题；
2、高效性：优化的反应体系与仪器快速温控模块（升降温速率6℃/s），使检测周期缩短至4-6h，可满足种子企业“随到随检”的质量控制需求，尤其适用于播种季前的紧急抽检；
3、易用性：仪器配套的智能化分析软件可自动生成标准曲线、计算纯度结果，并支持数据导出与溯源，降低了对操作人员的技术要求，便于基层检测机构推广应用。
（二）与其他技术的对比与应用场景拓展
相较于现有技术，荧光定量PCR仪应用场景更广泛：
1、对比形态学鉴定：无需等待种子萌发，可直接对干种子进行检测，不受生长周期限制；
2、对比普通PCR-电泳：无需凝胶制备与染色，减少人为操作误差，且可定量分析，而非仅定性判断；
3、未来拓展：可通过设计多品种特异性探针，实现同一反应体系中对多种作物种子的同时检测（如水稻与玉米混合样品），进一步提升检测效率。
（三）研究局限性与未来方向
本研究仅验证了博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪在水稻、玉米中的应用，对于棉花、大豆等其他作物，需进一步优化引物探针设计与反应体系；此外，针对未知品种的杂质鉴定，需结合高通量测序技术构建更全面的标记数据库。未来可联合博清生物开发“仪器-试剂-试剂盒”一体化的种子纯度检测解决方案，推动技术的产业化落地。
本研究以博清生物科技（南京）有限公司荧光定量PCR仪为核心，建立了基于SSR标记的种子纯度鉴定技术体系。结果表明，该仪器在水稻、玉米种子纯度检测中具有特异性强、灵敏度高（检测限0.1%）、准确性好（相对偏差<5%）、稳定性优（CV<3%）及效率高（4-6h完成检测）的特点，可有效解决传统鉴定方法耗时、低效、准确性低的问题。
博清生物荧光定量PCR仪为农业种子纯度鉴定提供了可靠的技术工具，可广泛应用于种子生产企业质量控制、农业行政监管及生物技术育种科研领域，对保障种业安全、推动农业生物技术产业化具有重要意义。
