纳米材料（尺寸 1-100 nm）因小尺寸效应、表面效应、量子效应等特性，在药物递送、生物成像、组织工程、抗菌治疗等领域展现出巨大应用潜力。然而，纳米材料的高表面活性易导致其与细胞内生物大分子（蛋白质、核酸、酶）发生相互作用，诱发氧化应激、细胞膜损伤、线粒体功能障碍、DNA 损伤等毒性效应，严重制约其临床应用转化。因此，建立快速、精准、高通量的细胞毒性评估方法，是纳米材料生物安全性评价的首要任务。
细胞毒性评估的核心是定量检测纳米材料对细胞活力、增殖、凋亡及生理功能的影响，常用方法包括 MTT 法、CCK-8 法、乳酸脱氢酶（LDH）释放法、活性氧（ROS）检测法等。上述方法均需通过酶标仪测定吸光度或荧光强度，实现毒性指标的间接定量。博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96 微孔板读数仪作为国产高性能酶标仪，集成线性 PMT 检测技术、双激发光源补偿技术、精准温控系统（室温 - 45℃）与高通量检测模式，具备高灵敏度（100 pg/ml）、高重复性（CV＜3%）、宽线性范围（0.000-3.000 Abs）等优势，可适配多种细胞毒性检测体系，为纳米材料的毒性评估提供标准化、自动化的技术平台。
一、基于博清生物酶标仪的纳米材料细胞毒性评估实验体系
（一）实验材料与仪器
1、实验材料：人宫颈癌细胞（HeLa）、小鼠胚胎成纤维细胞（L929）；银纳米颗粒（AgNPs，粒径 20 nm）、二氧化钛纳米颗粒（TiO₂NPs，粒径 50 nm）、氧化石墨烯（GO，片径 1-5 μm），实验室自制并通过 TEM、DLS 表征；MTT 试剂、CCK-8 试剂、LDH 检测试剂盒、ROS 检测试剂盒、GSH 检测试剂盒；DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素 - 链霉素双抗。
2、实验仪器：博清生物 WKB-96 微孔板读数仪；CO₂培养箱；超净工作台；高速离心机；透射电子显微镜；动态光散射仪。
（二）细胞培养
将 HeLa 细胞与 L929 细胞接种于含 10% FBS、1% 双抗的 DMEM 高糖培养基中，置于 37℃、5% CO₂、饱和湿度的 CO₂培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期（融合度 80%-90%），用 0.25% 胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度至 1×10⁴ cells/mL，用于后续毒性实验。
（三）纳米材料预处理
将 AgNPs、TiO₂NPs、GO 分别用 DMEM 培养基稀释至浓度梯度：0（空白对照）、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL，超声处理 30 min（40 kHz），确保纳米材料均匀分散，避免团聚对细胞毒性检测结果的干扰。
（四）基于博清生物酶标仪的毒性检测方法
1、CCK-8 法检测细胞活力
CCK-8 法基于活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶催化 WST-8 生成水溶性橙黄色甲臜产物，甲臜产量与活细胞数量成正比，无需有机溶剂溶解，操作简便、误差小。实验步骤：①将 1×10⁴ cells/mL 的细胞悬液接种于 96 孔板，每孔 100 μL，置于 CO₂培养箱培养 24 h；②弃去旧培养基，加入 100 μL 含不同浓度纳米材料的培养基，每组设置 6 个复孔，空白对照组加入不含纳米材料的培养基，阴性对照组加入含 10% FBS 的培养基，继续培养 24 h、48 h、72 h；③培养结束后，每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，置于 37℃培养箱避光孵育 2 h；④将 96 孔板置于博清生物酶标仪，设置检测波长 450 nm，参比波长 600 nm，测定各孔吸光度（OD 值）；⑤细胞存活率计算公式：细胞存活率（%）=（实验组 OD 值 - 空白对照组 OD 值）/（阴性对照组 OD 值 - 空白对照组 OD 值）×100%。
2、LDH 释放法检测细胞膜损伤
LDH 是细胞内稳定存在的酶，细胞膜损伤时释放至培养液中，其活性与细胞膜损伤程度成正比，是评估纳米材料急性毒性的重要指标。实验步骤：①细胞接种与纳米材料处理同 3.4.1，培养 24 h；②取各孔上清液 100 μL，转移至新的 96 孔板，加入 100 μL LDH 检测工作液，室温避光孵育 30 min；③用博清生物酶标仪测定 490 nm 波长下的 OD 值；④细胞膜损伤率计算公式：损伤率（%）=（实验组 OD 值 - 空白对照组 OD 值）/（最大释放组 OD 值 - 空白对照组 OD 值）×100%（最大释放组为细胞经 1% Triton X-100 处理 1 h 的上清液）。
3、ROS 检测法评估氧化应激水平
纳米材料可诱导细胞产生过量 ROS，引发氧化应激损伤，是其细胞毒性的核心机制之一。实验步骤：①细胞接种与纳米材料处理同 3.4.1，培养 12 h；②弃去上清液，加入 10 μmol/L DCFH-DA 荧光探针，37℃避光孵育 20 min，PBS 洗涤 3 次；③将 96 孔板置于博清生物酶标仪荧光检测模式，设置激发波长 488 nm、发射波长 525 nm，测定各孔荧光强度；④ROS 相对水平计算公式：ROS 相对水平 = 实验组荧光强度 / 阴性对照组荧光强度。
4、GSH 检测法评估抗氧化能力
GSH 是细胞内重要的抗氧化物质，可清除过量 ROS，其含量降低提示细胞氧化应激损伤加剧。实验步骤：①细胞接种与纳米材料处理同 3.4.1，培养 24 h；②弃去上清液，PBS 洗涤细胞 2 次，每孔加入 100 μL 细胞裂解液，冰上裂解 30 min，4℃、12000 r/min 离心 10 min，取上清液；③按照 GSH 检测试剂盒说明书操作，加入试剂后室温反应 15 min；④用博清生物酶标仪测定 405 nm 波长下的 OD 值，计算 GSH 含量。
二、实验结果与分析
（一）纳米材料对细胞活力的影响（CCK-8 法）
博清生物酶标仪检测结果显示，三种纳米材料对 HeLa 细胞与 L929 细胞的活力均呈现浓度依赖性抑制作用，且具有时间依赖性（图 1）。低浓度（6.25-25 μg/mL）时，AgNPs、TiO₂NPs、GO 对细胞活力无显著影响（存活率＞90%，P＞0.05），表明低浓度纳米材料具有良好的生物相容性；随着浓度升高（50-200 μg/mL），细胞存活率显著下降（P＜0.05），其中 AgNPs 毒性最强，200 μg/mL 处理 24 h 后，HeLa 细胞存活率仅为 42.3%±3.1%，L929 细胞存活率为 45.6%±2.8%；TiO₂NPs 次之，GO 毒性相对较低，200 μg/mL 处理 24 h 后细胞存活率仍＞60%。
时间依赖性结果显示，同一浓度下，随着培养时间延长（24 h→72 h），细胞存活率进一步降低，200 μg/mL AgNPs 处理 72 h 后，HeLa 细胞存活率降至 21.5%±2.3%，提示纳米材料的细胞毒性具有累积效应。博清生物酶标仪检测数据重复性好（CV＜2.0%），组间差异显著，可精准区分不同浓度、不同类型纳米材料的毒性差异。
（二）纳米材料对细胞膜完整性的影响（LDH 释放法）
LDH 检测结果表明，纳米材料诱导细胞 LDH 释放量随浓度升高而显著增加（图 2），与 CCK-8 法细胞活力结果呈负相关（r=-0.98，P＜0.01）。低浓度（≤25 μg/mL）时，LDH 释放率＜10%，细胞膜完整性良好；高浓度（≥50 μg/mL）时，LDH 释放率显著升高，200 μg/mL AgNPs 处理 24 h 后，HeLa 细胞 LDH 释放率达 58.7%±4.2%，表明高浓度纳米材料可严重损伤细胞膜，导致细胞内容物泄漏，引发细胞死亡。博清生物酶标仪在 490 nm 波长下检测灵敏度高，可清晰捕捉 LDH 释放的微弱变化，为纳米材料急性毒性评估提供可靠依据。
（三）纳米材料对细胞氧化应激水平的影响（ROS 与 GSH）
ROS 检测结果显示，纳米材料处理后细胞内 ROS 水平显著升高，呈浓度依赖性。200 μg/mL AgNPs 处理 12 h 后，HeLa 细胞 ROS 相对水平为阴性对照组的 2.8 倍 ±0.3 倍；TiO₂NPs 与 GO 处理后 ROS 相对水平分别为 2.1 倍 ±0.2 倍、1.5 倍 ±0.1 倍，与细胞毒性强弱一致。GSH 检测结果显示，细胞内 GSH 含量随纳米材料浓度升高而显著降低，200 μg/mL AgNPs 处理 24 h 后，GSH 含量降至阴性对照组的 35.2%±3.5%，表明纳米材料诱导的过量 ROS 消耗了细胞内大量抗氧化物质，破坏了氧化 - 抗氧化平衡，引发氧化应激损伤，这是纳米材料细胞毒性的重要机制。博清生物酶标仪荧光检测模式灵敏度高、背景干扰低，可精准定量细胞内 ROS 水平；吸光度模式可稳定检测 GSH 含量，实现氧化应激与抗氧化能力的联动评估。
（四）博清生物酶标仪的性能验证
通过对比博清生物酶标仪与进口某品牌酶标仪的检测结果，发现两种设备对同一批样品的检测数据无显著差异（P＞0.05），相关性高达 0.995。博清生物酶标仪的重复性（CV=0.8%-1.5%）优于进口设备（CV=1.2%-2.0%），且检测速度更快（96 孔板检测时间缩短 2-3 s），价格仅为进口设备的 1/3-1/2，性价比优势显著。
三、讨论
纳米材料的细胞毒性受粒径、形貌、表面电荷、浓度、作用时间等多种因素影响，其毒性机制复杂，涉及细胞膜损伤、线粒体功能障碍、氧化应激、DNA 损伤、炎症反应等多个方面。本研究基于博清生物酶标仪，建立了 CCK-8、LDH、ROS、GSH 多指标联动检测体系，系统评估了 AgNPs、TiO₂NPs、GO 三种典型纳米材料的细胞毒性，结果表明：纳米材料的细胞毒性具有浓度依赖性与时间依赖性，低浓度生物相容性良好，高浓度通过诱导氧化应激、损伤细胞膜引发细胞死亡；毒性强弱顺序为 AgNPs＞TiO₂NPs＞GO，与文献报道一致。
博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪在纳米材料细胞毒性评估中展现出显著优势：①高精准度：线性 PMT 检测技术与抗干扰光学系统，有效避免纳米材料自身光学特性的干扰，检测结果准确可靠，重复性好；②高通量高效率：96 孔板并行检测，可同时完成多材料、多浓度、多指标检测，大幅提升实验效率，适配纳米材料大规模筛选需求；③多功能集成：单一设备覆盖吸光度、荧光、化学发光检测模式，可实现细胞活力、细胞膜损伤、氧化应激、抗氧化能力等多指标联动检测，全面解析纳米材料毒性机制；④高性价比：国产设备价格亲民，性能媲美进口设备，适合普通科研实验室普及应用，推动纳米材料生物安全性评价的标准化与规范化。
博清生物科技（南京）有限公司研发的WKB-96 微孔板读数仪凭借高灵敏度、高精准度、高通量、多功能、高性价比等优势，可完美适配纳米材料细胞毒性评估的技术需求，依托 CCK-8、LDH、ROS、GSH 等经典检测方法，能够实现纳米材料细胞活力、细胞膜完整性、氧化应激水平、抗氧化能力等多指标的高效、精准定量检测，全面解析纳米材料的毒性效应与机制。该设备的应用，为纳米材料生物安全性评价提供了标准化、自动化、普及化的技术支撑，有助于推动纳米生物技术的健康发展与转化应用，在生物医学、材料科学、环境毒理学等科研领域具有广阔的应用前景。
