蛋白与小分子（如药物分子、代谢物）、蛋白与核酸（DNA/RNA）的相互作用广泛参与基因表达调控、信号传导、物质运输等关键生命过程。精准获取生物分子相互作用的亲和力参数（如结合常数、解离常数）、结合模式等信息，是解析生命活动机制、开展药物靶点筛选与验证的核心前提。目前，检测生物分子相互作用的技术主要包括凝胶阻滞实验（EMSA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、微量热泳动（MST）及荧光光谱法等。其中，荧光光谱法因具有灵敏度高、样品用量少、操作简便、可实时监测等优势，成为生物分子相互作用研究的常用技术手段。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计作为一款紧凑型微量检测设备，具备1-20μL微量样品检测能力，其集成化光路设计可兼容多种荧光染料与探针，配合精准的控温系统和智能分析软件，为荧光检测实验提供了稳定可靠的平台。本研究旨在系统验证博清生物荧光计在蛋白-小分子及蛋白-核酸相互作用检测中的适用性，建立标准化的实验方法，为该仪器在生命科学研究领域的推广应用提供实验依据。
一、材料与方法
（一）实验材料
牛血清白蛋白（BSA，纯度≥98%）、芦丁（纯度≥98%）、NLRP6蛋白（重组表达纯化）、dsRNA（人工合成，长度50bp）、FAM荧光标记dsRNA探针、Tris-HCl缓冲液（0.05 M，pH 7.4）、DMSO（色谱纯）；实验用水为超纯水（电阻率≥18.2MΩ·cm）。
实验仪器为博清生物荧光计，支持2通道荧光检测；石英比色皿（光程1cm）；微量移液器（1-10μL、10-100μL）；恒温培养箱。
（二）实验方法
1、蛋白-小分子相互作用检测（BSA-芦丁体系）
溶液配制：用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）配制3.0×10⁻⁶mol·L⁻¹的BSA溶液和3.75×10⁻⁴mol·L⁻¹的芦丁储备液（含5% DMSO，DMSO终浓度≤0.5%，避免影响蛋白构象）。
荧光滴定实验：移取2.5mL BSA溶液至石英比色皿中，置于博清生物荧光计样品台，设定激发波长280nm，激发/发射狭缝宽度均为5.0nm，扫描速度500nm·min⁻¹，扫描290-400nm范围内的荧光发射光谱，记录空白荧光强度F₀。随后，用微量注射器逐次加入芦丁储备液，每次加入后混匀，室温孵育10min，在相同参数下测定荧光发射光谱，记录不同芦丁浓度下的荧光强度F（滴定剂累加体积≤65μL，确保体系浓度变化可忽略）。
2、蛋白-核酸相互作用检测（NLRP6-dsRNA体系）
溶液配制：用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）配制2.0×10⁻⁶mol·L⁻¹的NLRP6蛋白溶液和1.0×10⁻⁶mol·L⁻¹的FAM标记dsRNA探针溶液。将dsRNA探针进行2倍梯度稀释，得到16个浓度梯度（1.95×10⁻⁸-1.0×10⁻⁶ mol·L⁻¹）。
FRET检测实验：将不同浓度的dsRNA探针与等体积NLRP6蛋白溶液混合，室温孵育15min，形成反应体系（总体积30μL）。设置博清生物荧光计激发波长为488nm（FAM激发波长），发射波长为520nm（FAM发射波长），测定各反应体系的荧光强度。同时设置未标记dsRNA竞争组（过量未标记dsRNA与FAM标记探针竞争结合NLRP6）和空白对照组（无NLRP6蛋白的探针溶液）。
验证实验：采用EMSA实验验证相互作用，按照常规方法配制PAGE凝胶，将NLRP6蛋白与dsRNA探针孵育后上样电泳，经化学发光成像系统显影分析。
二、结果与分析
（一）博清生物荧光计性能验证
实验前对博清生物荧光计的核心性能进行验证：在488nm激发、520nm发射条件下，对不同浓度的FAM标准溶液进行检测，结果显示荧光强度与FAM浓度在1.0×10⁻⁹-1.0×10⁻⁶mol·L⁻¹范围内呈良好的线性关系（R²=0.9992），最低检测限为3.2×10⁻¹⁰mol·L⁻¹，表明仪器具备高灵敏度；对同一样品进行6次重复检测，相对标准偏差（RSD）为1.2%，证明仪器检测精度优异。此外，仪器的5寸彩色触摸屏操作便捷，程序设置快速，样品台采用抽屉式设计，取放样品高效安全，符合科研实验的高效性需求。
（二）蛋白-小分子相互作用检测结果（BSA-芦丁体系）
1、荧光猝灭光谱特征：在280nm激发下，BSA在341nm处出现强荧光发射峰，对应其分子内色氨酸和酪氨酸残基的内源荧光。随着芦丁浓度的增加，BSA的荧光强度逐渐降低，且荧光发射峰从341nm红移至350nm，表明芦丁与BSA发生了相互作用，导致BSA分子构象改变，疏水腔内的色氨酸残基暴露于极性更强的环境中。
2、猝灭类型与结合参数：根据Stern-Volmer方程拟合得到不同温度（298K、308K）下的Kₛᵥ值分别为4.2×10⁴L·mol⁻¹和3.5×10⁴L·mol⁻¹，Kₛᵥ随温度升高而降低；计算得到的荧光猝灭速率常数K_q均大于2.0×10¹⁰L·mol⁻¹·s⁻¹（生物大分子动态猝灭的最大K_q值），表明芦丁对BSA的荧光猝灭为静态猝灭，即二者形成了稳定的基态复合物。通过log[(F₀-F)/F]-log[Q]曲线拟合，得到298K时的结合常数Kₐ=2.36×10⁵L·mol⁻¹，结合位点数n=1.02≈1，说明BSA与芦丁之间存在1:1的特异性结合，且结合能力较强。
（三）蛋白-核酸相互作用检测结果（NLRP6-dsRNA体系）
1、FRET检测结果：随着dsRNA探针浓度的增加，NLRP6-dsRNA反应体系的荧光强度逐渐增强，当dsRNA浓度达到8.0×10⁻⁷mol·L⁻¹时，荧光强度趋于稳定，表明反应达到结合平衡。空白对照组荧光强度无明显变化，未标记dsRNA竞争组的荧光强度显著低于同浓度下的实验组，证明NLRP6与dsRNA的结合具有特异性。通过曲线拟合计算得到解离常数Kᴰ=1.18μM，与文献报道的NLRP6优先结合dsRNA的结果一致。
2、EMSA验证结果：EMSA实验显示，当NLRP6蛋白与FAM标记dsRNA探针孵育后，出现滞后的电泳条带，而未标记dsRNA竞争组的滞后条带强度明显减弱，空白对照组无滞后条带，进一步证实NLRP6与dsRNA存在特异性相互作用，与博清生物荧光计的检测结果相互印证，说明该荧光计检测数据可靠。
三、讨论
生物分子相互作用的精准检测依赖于高性能的检测设备。本研究通过两个经典的生物分子相互作用模型，系统验证了博清生物荧光计的应用效能。在蛋白-小分子相互作用检测中，该仪器成功捕捉到芦丁对BSA的静态荧光猝灭过程，准确测定了结合常数和结合位点数，其检测灵敏度可满足低浓度生物样品的分析需求；在蛋白-核酸相互作用检测中，借助FRET技术实现了NLRP6与dsRNA结合过程的定量分析，解离常数测定结果与EMSA验证结果相符，证明仪器具备良好的准确性。
与传统的荧光检测设备相比，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计具有显著优势：其一，样品用量仅需1-20μL，可有效减少珍贵生物样品（如纯化蛋白、稀有核酸）的消耗；其二，集成化光路设计支持多通道检测，可兼容多种荧光标记探针，适用于不同类型的生物分子相互作用检测；其三，精准的控温系统和智能分析软件简化了实验操作流程，缩短了实验周期，提高了科研效率。此外，仪器的抽屉式样品台设计提升了操作安全性，5寸触摸屏便于实验参数设置和数据查看，更符合科研人员的实际操作需求。
本研究也存在一定局限性，如未探讨pH、离子强度等环境因素对检测结果的影响，后续可进一步优化实验条件，扩大仪器的应用范围。同时，博清生物荧光计还可结合荧光偏振、荧光寿命等检测模式，实现对生物分子相互作用机制的更深入解析。
本研究建立了基于博清生物荧光计的蛋白-小分子/核酸相互作用检测方法，通过BSA-芦丁和NLRP6-dsRNA两个模型的验证，证实该仪器可准确、高效地完成生物分子相互作用的定性与定量分析，具备高灵敏度、高准确性和操作便捷性的特点。该仪器可广泛应用于药物研发、分子生物学、生物化学等领域的相关科研工作，为生物分子相互作用研究提供可靠的技术支撑。
