细菌性感染是临床常见的感染类型，其病原体（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等）可引发肺炎、泌尿系统感染、败血症等多种疾病，严重时危及生命。及时、准确的病原体检测是指导临床合理用药、降低并发症发生率的关键。目前，临床常用的细菌检测方法以传统培养法为主，但该方法存在检测周期长（24~48h）、灵敏度有限等缺陷，难以满足急性细菌性感染的快速诊断需求。
酶标仪作为酶联免疫技术的核心检测设备，凭借其自动化程度高、检测速度快、结果可量化等特点，已广泛应用于病原体检测领域。博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪是针对免疫检测优化设计的设备，具备双波长检测、多通道同步读取、数据自动分析等功能，理论上可提升病原体检测的效率与准确性。本研究通过建立基于该仪器的ELISA检测体系，系统评估其在细菌性感染病原体检测中的性能，为其科研转化与临床应用提供实验依据。
一、材料与方法
（一）实验材料
1、菌株来源：本研究选取6种临床常见致病菌（金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、奇异变形杆菌ATCC 12453、表皮葡萄球菌ATCC 12228、粪肠球菌ATCC 29212）及3种非目标菌株（白色念珠菌ATCC 10231、铜绿假单胞菌ATCC 27853、鲍曼不动杆菌ATCC 19606），均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。
2、试剂：致病菌特异性单克隆抗体（抗金黄色葡萄球菌α-溶血素抗体、抗大肠杆菌O157抗原抗体等）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗、3,3',5,5'- 四甲基联苯胺（TMB）底物液、封闭液（5%脱脂奶粉）；LB培养基、PBS缓冲液（pH7.4）由实验室自行配制。
3、仪器：博清生物酶标仪、恒温培养箱、高速离心机、超净工作台。
（二）实验方法
1、菌株培养与样本制备
将各致病菌接种于LB培养基，37℃恒温培养12h后，用PBS缓冲液调整菌液浓度至10⁶ CFU/mL，再通过梯度稀释得到10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL的系列浓度菌液，作为检测样本；非目标菌株按相同方法培养并制备成10⁶CFU/mL菌液，用于特异性验证。
2、ELISA 检测体系建立
包被：将致病菌特异性单克隆抗体用包被缓冲液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至2μg/mL，每孔加100μL至96孔酶标板，4℃孵育12h后，用PBST缓冲液（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。
封闭：每孔加200μL 5%脱脂奶粉封闭液，37℃孵育1h，PBST洗涤3次。
加样与孵育：每孔加100μL系列浓度菌液（空白对照加 PBS），37℃孵育1.5 h，PBST洗涤3次。
加酶标二抗：将HRP标记的二抗用封闭液稀释至1:5000，每孔加100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤5次。
显色与终止：每孔加100μL TMB底物液，37℃避光孵育15min，随后加50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应。
3、博清生物酶标仪检测参数设置
采用博清酶标仪进行检测，设置检测波长为450 nm（TMB显色主峰），参考波长为630nm（消除背景干扰），选择“双波长差值”检测模式，自动读取每孔吸光度值（OD₄₅₀₋₆₃₀）。以OD值≥0.2且大于空白对照OD值2倍判定为阳性。
4、性能评估实验
重复性验证：选取10³CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌液各1份，每份样本平行检测10次（批内重复），连续检测5d（批间重复），计算CV值（CV=标准差/平均值×100%）。
特异性验证：检测6种目标致病菌（10⁴CFU/mL）及3种非目标菌株（10⁶CFU/mL），记录阳性率，评估交叉反应。
灵敏度验证：检测系列浓度（10¹~10⁶ CFU/mL）的目标致病菌菌液，以阳性判定标准确定最低检测限（LOD）。
检测效率对比：分别采用博清酶标仪ELISA法与传统培养法检测20份模拟感染样本（含 10³CFU/mL 目标菌），记录两种方法的检测周期及阳性符合率。
二、结果
（一）重复性结果
博清生物酶标仪对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的批内CV分别为2.8%、3.2%，批间CV分别为4.1%、4.5%，均小于5%，表明仪器检测重复性良好。
（二）特异性结果
6种目标致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等）均检测为阳性，3种非目标菌株（白色念珠菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌）均检测为阴性，无交叉反应，特异性达100%。
（三）灵敏度结果
博清生物酶标仪对6种目标致病菌的最低检测限均为10² CFU/mL，而传统培养法的最低检测限为10³CFU/mL，仪器灵敏度显著优于传统方法。
（四）检测效率对比
20份模拟感染样本中，博清酶标仪ELISA法与传统培养法的阳性符合率均为100%，但前者检测周期仅为4~6h，后者需24~48h，检测效率提升4~6倍。
三、讨论
细菌性感染的早期诊断依赖于快速、准确的病原体检测技术。本研究针对博清生物酶标仪的性能验证结果表明，该仪器在细菌性感染病原体检测中具有显著优势：
1、高稳定性与特异性：批内、批间CV均小于5%，符合免疫检测的重复性要求；且对非目标菌株无交叉反应，可有效避免误诊，这得益于仪器的双波长检测模式——通过参考波长（630nm）消除样本浊度、酶标板吸附差异等背景干扰，提升结果准确性。
2、高灵敏度与快速性：最低检测限达10²CFU/mL，优于传统培养法，可检测低浓度感染样本，减少漏诊；同时，检测周期缩短至4~6h，解决了传统培养法“耗时久”的痛点，有助于临床在感染早期启动针对性治疗，降低抗生素滥用风险。
本研究仍存在局限性：样本类型仅覆盖纯菌液与模拟感染样本，未纳入临床真实样本（如血液、尿液），后续需进一步验证仪器在复杂基质中的检测性能；此外，研究仅针对6种常见致病菌，对耐药菌株（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）的检测适用性仍需拓展。
未来可结合核酸扩增技术（如PCR）与博清酶标仪的检测优势，开发“核酸-免疫联合检测”体系，进一步提升灵敏度；同时，优化仪器的自动化流程，实现样本加样、孵育、检测的一体化，适配更多临床样本类型，推动其在基层医疗机构的普及应用。
本研究通过重复性、特异性、灵敏度及检测效率的系统评估，证实博清生物科技（南京）有限公司研发的酶标仪在细菌性感染病原体检测中具有稳定、特异、灵敏、快速的核心优势，可满足科研阶段的致病菌筛查需求，并为临床细菌性感染的早期诊断提供可靠的技术支持，具有较高的应用价值与转化潜力。
