在农业生物技术快速发展的背景下，精准高效的分子检测技术成为作物遗传改良与抗病育种的关键支撑。
全球粮食安全面临着作物产量提升与生物胁迫防控的双重挑战。传统育种方法周期长、效率低，难以满足现代农业对优良品种的迫切需求。分子生物学技术的进步为作物遗传改良提供了新途径，其中实时荧光定量PCR技术因其高特异性、高灵敏度和准确定量能力，已成为基因表达分析、分子标记筛选和病原菌检测的核心手段。
博清生物科技（南京）有限公司作为专注于生命科学仪器研发的企业，其荧光定量PCR仪在农业生物技术领域展现出独特优势。该仪器融合了快速升降温技术、多通道荧光检测系统和便携化设计，既满足实验室高通量分析需求，又可实现田间现场检测。
一、材料与方法
（一）仪器性能参数
本研究采用博清生物荧光定量PCR仪，其核心技术参数如下：样本容量为8×0.2mL透明PCR管，支持20-100μL反应体系；采用帕尔贴加热制冷方式，温度范围4-100℃，温度准确性±0.1℃，均一性±0.15℃；配备4个高效单色LED光源和SiPMT检测器，激发/发射波长范围455-650nm/510-750nm，支持FAM/SYBR Green、VIC/HEX、ROX、Cy5等常用荧光染料；仪器重量仅1.4kg，可电池供电，适用于野外现场检测。
（二）实验方法优化
1、核酸提取与质量控制
采用CTAB法提取作物叶片基因组DNA或总RNA，使用NanoDrop测定A260/A280比值（1.9-2.1）和浓度，通过琼脂糖凝胶电泳验证核酸完整性（28S/18S≥1.5）。RNA样本经DNaseⅠ处理去除基因组DNA污染，设置无逆转录对照（No-RT control）验证处理效果，要求Cq值≥35。
2、qPCR反应体系配置
优化后的20μL反应体系包含：2×TaqMan混合液10μL，上、下游引物各0.5μL（终浓度0.2-0.5μmol/L），探针 0.4μL（终浓度 0.2μmol/L），模板 DNA/cDNA 1μL（20ng/μL），ddH₂O补足体积。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火延伸35s，40个循环，在退火延伸阶段收集荧光信号。
3、数据分析方法
采用2^(-ΔΔCt) 法进行基因相对表达量分析，以β-actin作为内参基因。设置3次技术重复和3次生物学重复，结果以平均值±标准差表示。使用仪器自带软件进行熔解曲线分析，验证扩增产物特异性，要求单一熔解峰且无引物二聚体干扰。
二、结果与分析
（一）在作物育种中的应用
1、基因拷贝数变异分析
在芥菜叶形改良研究中，利用博清生物qPCR仪检测BjRCO基因拷贝数变异。结果显示，裂叶芥菜品种中BjRCO基因拷贝数显著高于圆叶品种（P<0.01），与重测序数据的相关性达到0.96，证实该方法准确性。通过优化Mg²⁺浓度（2.5mM）和退火温度（60℃），检测变异系数（CV）降至1.2%，较传统PCR方法灵敏度提高10倍。
2、分子标记辅助选择
在大白菜高活力种子选育中，基于BraPYL分子标记开发的qPCR检测体系，可快速区分高活力种子（323bp单一条带）。博清仪器的4通道检测能力实现了目标片段与内参基因的同步扩增，检测时间较琼脂糖电泳法缩短6小时，且在种子萌发早期（24h）即可准确预测活力水平。田间试验表明，该方法筛选的高活力种子出苗率提高23%，显著优于传统发芽试验。
（二）在抗病研究中的应用
1、抗病基因表达动态监测
在水稻纹枯病抗性研究中，采用博清qPCR仪分析接种后24h和48h免疫相关基因的表达变化。结果显示，抗病品种"月亮谷"中WARK71和WARK53基因表达量分别上调8.3倍和6.7倍，显著高于感病品种（P<0.05），且两个时间点的表达差异通过高分辨率熔解曲线得到有效区分。仪器的快速升降温功能（6℃/s）使每个反应循环时间缩短至45s，全天可完成96个样本的8重基因检测。
2、病原菌多重检测体系
针对烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY），建立基于博清qPCR仪的三重检测方法。优化后的体系检测下限分别达到2.60×10¹、1.25×10¹和2.33×10¹copies/μL，批内与批间CV均<1.5%。田间样本检测显示，该方法与单重PCR结果一致性达100%，但检测效率提升3倍，且通过便携设计实现了田间采样后3小时内获得检测结果。
三、讨论
博清生物qPCR仪在农业应用中的技术优势主要体现在三个方面：其一，高灵敏度检测能力（低至10copies/μL）使其能够准确量化作物基因组中的低丰度变异和病原菌早期侵染信号，这对于抗病基因的精细定位至关重要；其二，多通道荧光检测系统支持多重反应同时进行，显著降低了育种筛选成本，如在三重病毒检测中试剂消耗量减少60%；其三，便携化设计突破了传统实验室检测的时空限制，特别适用于偏远地区的田间快速诊断。
与同类产品相比，博清仪器的温度均一性（±0.15℃）确保了检测数据的高重复性，这在基因表达谱分析中尤为重要。其独特的光学系统设计无需频繁校准，长期使用稳定性优于同类进口产品，年度维护成本降低约30%。在实际应用中，该仪器成功实现了从实验室基因分型到田间抗病性验证的全链条技术支持，将传统育种中的表型选择周期从generations 缩短至分子水平的数月。
本研究也存在一定局限性：首先，部分作物特异性标记的qPCR体系仍需进一步优化；其次，仪器的高通量检测能力在大规模育种群体筛选中略显不足。未来可通过开发384孔板模块和自动化样本处理系统加以改进。此外，结合数字PCR技术实现绝对定量，将进一步提升检测精度，特别是在基因编辑作物的拷贝数验证中具有应用潜力。
博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪通过整合高灵敏度检测、多通道分析和便携化设计三大核心技术，为作物育种与抗病研究提供了一体化解决方案。在作物遗传改良中，该技术显著提升了基因拷贝数变异检测和分子标记筛选的效率；在抗病研究中，实现了抗病基因表达动态监测和病原菌快速鉴定的精准化。实践证明，博清生物qPCR技术能够有效缩短育种周期、提高抗病品种培育效率，对推动农业生物技术创新和精准农业发展具有重要实践意义。未来通过与基因组编辑、大数据分析等技术的深度融合，有望在作物分子设计育种中发挥更大作用。
